Лабораторная диагностика
Материал для исследований: Кожные и ногтевые чешуйки, слизь, мокрота, гной, кал, моча, СМЖ, биоптаты тканей.
1. Микроскопический метод-окрашивание мазков по Граму, метиленовым синим или др. способом.
2. Микологический метод: посев исследуемого материала на питательные среды (агар Сабуро, сусло-агар или Кандида-агар).
3. Серологический метод: РСК, РА (диагностические титры 1:160—1:1600), иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез, РНГА, ИФА, ПЦР.
47. Патогенные и условно-патогенные грибы. Классификация грибов по группам патогенности.
Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это многоклеточные или одноклеточные нефотосинтезирующие (бесхлорофильные) эукариотические микроорганизмы с клеточной стенкой.
1. Патогенные микромицеты – всегда вызывают заболевания
· Дерматомицеты ( нитчатые микромицеты)
-Дерматофиты - грибы из родов Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton - являются возбудителями дерматофитии
· Возбудители эндемичных микозов ( диморфные микромицеты)
- Histoplasma capsulatum (вызывает гистоплазмоз),, Blastomyces dermatidis (бластомикоз), Coccidioides immitis(кокцидиоидоз), Paracoccidioides brasiliensis (паракокцидиоидоз), Talaromyces marneffei. Это возбудители респираторных эндемических микозов. ). Все эти грибы относятся к III группе патогенности, а по уровню биологической угрозы для персонала лабораторий - к 3 группе.
2. Условно-патогенные микромицеты – вызывают заболевания при определенных условиях
· Дрожжевые грибы ( Malassezia spp., Trichosporon spp., Candida spp., Cryptococcus spp.)
-возбудитель разноцветного лишая - дрожжевой гриб из отдела Basidiomycota – Malasseizia furfur. Это липофильный гриб, заселяющий кожу преимущественно на участках, богатых кожным салом
- Белая и черная пьедра - это тропические инфекции волосистой части головы. Возбудителем трихоспороноза или белой пьедры являются разные виды рода Trichosporon. Это дрожжевые грибы из отдела Basidiomycota. При белой пьедре образуются светлые или коричневатые узелки на стержне волоса, отчего последние часто обламываются. Отличительной особенностью Trichosporon spp. является образование артроконидий (другие дрожжевые грибы их не образуют). Возбудителем черной пьедры является плесневой темнопигментированный гриб Piedraia hortae. В узелках черной пьедры содержатся типичные для Ascomycota аскоспоры (элементы половой стадии).
- Возбудителями кандидоза является около 20 видов дрожжевых грибов из рода Candida (несовершенные дрожжи из отдела Ascomycota). Основные виды-возбудители кандидоза: С. albicans, С. parapsilosis, С. tropicalis, С. glabrata, С. krusei.
- Возбудителем криптококкоза (европейский бластомикоз, болезнь Буссе-Бушке) является дрожжевой гриб Cryptococcus neoformans
· Мицелиальные грибы ( Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Lichtheimia spp., Aspergillus spp.
- К возбудителям аспергиллеза относят несколько видов несовершенных плесневых грибов из рода Aspergillus. Наиболее часто ими являются следующие виды Aspergillus: A. fumigatus, реже A. flavus, A. niger, A. Terreus
-Возбудители мукороза относятся к порядку Mucorales из отдела Zygomycota. Ими являются условно-патогенные виды Rhizopus arrhizus, Absidia corymbifera (главные виды), некоторые грибы из родов Rhizopus, Mucor, Cunninghamella, Mortierella, Saksnaea, и другие. Материал для исследования: пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ног тей, кожные и ногтевые соскобы, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражне ния, биоптаты и др
48. Принципы лабораторной диагностики микозов 1)Экспресс-диагностика: РИФ, ПЦР 2)Микроскопический метод: исследование нативных и окрашенных препаратов с целью обнаружения элементов гриба (мицелия, спор).Микроскопический метод играет важную роль в диагностике микозов, т.к. дает возможность быстро выявить в нативных и окрашенных препаратах наличие и расположение клеток, спор гриба и нитей мицелия в патологическом материале. Наиболее часто для окраски грибов применяют общепринятые методы Грама, Романовского-Гимза, Циля-Нильсена, Бурри. Разработан также широкий набор специальных методов окраски грибов. 3)Микологический метод: посев на специальные питательные среды (Сабуро ). Идентификация выделенной культуры гриба на основании характеристики колоний, микроскопического строения гриба, а также по биохимическим и другим признакам. 4)Серологический метод: определение антител к грибам или их антигенам в сыворотке крови больных микозами с помощью РА, РСК, РНГА, РИФ, ИФА, иммуноблотинга 5)Аллергический метод: постановка внутрикожных аллергических проб с грибковыми аллергенами 6)Биопроба: заражение чувствительных жи вотных с последующим выделением чистой культуры гриба 7)Микологический метод (выделение чистой культуры гриба и ее идентификация) является важнейшей составной частью лабораторного исследования при микозах. Посевы производят на специальные плотные и жидкие (неселективные и селективные) питательные среды (среды Сабуро – мальтозо-пептонная, ; кукурузный, рисовый, картофельный, кровя ной, шоколадный, сердечно-мозговой, угольно-дрожжевой агар и т.д.). Селективные среды содержат антибиотики (левомицетин, стрептомицин, пенициллин и др.), красители (бенгальский розовый и др.) или дезинфицирующие вещества. В отличие от слабощелочных сред для выращивания большинства бактерий, среды для культивирования грибов имеют кислую или слабокислую рН (5,7-6,8). Для первичной дифференциации грибов разработан агар CHROM с хромогенными субстратами, расщепляющимися ферментами грибов с образованием окрашенных соединений, в результате чего колонии различных видов грибов окрашиваются в разные цвета – красный, желтый, белый, кремовый, ко ричневый, черный и т.д. Культивирование грибов осуществляют обычно при температуре 22-280 С в течение 2-4 недель. Идентификацию выделенной культуры гриба проводят на основании характеристики колоний (внешний вид, форма, консистенция, цвет), микроскопического строения гриба (строение мицелия, форма и расположение конидиеносцев и конидий – спор), а также по биохимическим и другим признакам. +Аллергический метод – постановка внутрикожных аллергических проб. Проводят с грибковыми аллергенами, представляющих собой взве си из убитых грибов, фильтраты обезвреженных нагреванием культур, полисахаридные и бел ковые фракции клеток гриба. Результаты аллергических проб учитывают через 20 мин (не медленные) и через 24-48 ч (замедленные реакции). Для выявления грибковой сенсибилизации организма также применяют иммунологические тесты in vitro (дегрануляция базофилов как тест гиперчувствительно сти немедленного типа, а для выявления гиперчувстви тельности замедленного типа - реакцию торможения миграции лейкоцитов или бласттрансформации лимфоцитов). Биопроба - заражение чувствительных жи вотных (мыши, крысы, хомяки, кролики, морские свинки, соба ки, кошки) различными способами (накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутрисердечно, интрацеребрально, перорально, интратрахеально) для выделения чистой культуры гриба. Гистологический метод направлен на обнару жение гриба в тканях, полученных при биопсии и аутопсии. Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления в материале от больного специфических фрагментов ДНК грибов, позволяющая вы явить
около 40 видов грибов, в том числе Candida albicans и ее варианты, Т. rubrum и С. neoformans, различные виды Aspergillus, возбудителей паракокцидиоидомикоза (Paracoccidioides brasiliensis) и гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum).