8. Бактериофаги. Получение, титрование. Практическое применение в диагностике, профилактике и лечение

Бактериофаги — вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их растворение (лизис).

Бактериофаг обладает всеми основными свойствами, присущими вирусам, а именно:

1) имеет элементарные частицы величиною в пределах от 20 до 200 нм;

2) содержит в своем составе нуклеиновую кислоту и белок;

3) не растет на искусственных питательных средах, размножаясь только внутри клеток микробов;

4) обладает высокой специфичностью в отношении поражаемой клетки;

5) имеет антигенную обособленность от клетки хозяина.

Получение бактериофага в настоящее время осуществляется в специальных аппаратах - реакторах, емкостью от 250 до 1000 л, с применением аэрации (как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов).

Для производства бактериофага берется его рабочая маточная раса и соответствующие культуры микробов.

1. В реактор наливается жидкая питательная среда, например, бульон Мартена или Хоттингера для изготовления брюшнотифозного и дизентерийного бактериофагов с рН 7,4-7,6 и стерилизуется при температуре 110 °С в течение 40 минут.

2. После стерилизации среда охлаждается до 39 °С и засеивается соответствующей микробной культурой и маточным бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляются из расчета 50 млн. микробных тел на 1 мл среды. Бактериофаг добавляется в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды.

3. Среду с засеянными в ней культурой и бактериофагом оставляют при температуре 37 °С на 6-18 часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактериальных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды.

4. К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реактора фильтруется через бактериальные фильтры (асбестовые пластины, свечи Шамбеолена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток.

5. Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность, т.е. вирулентность.

Дополнительно:

Стерильность бактериофага проверяют обычным способом.

Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3-4 суток; если препарат безвреден, они должны оставаться бодрыми и здоровыми.

Литическая активность бактериофага, его вирулентность определяются методом титрования на жидкой и плотной питательной среде.

Титрование бактериофага осуществляется по количеству активных корпускул фага, содержащихся в 1 мл исследуемого фильтрата и обеспечивающих лизис тест-культуры.

Титр выражают отрицательным логарифмом, в котором степень указывает на разведение фага (10 -4, 10 -7).

1 .Титрование бактериофага по Аппельману:

- составить ряд из 8 сухих чистых пробирок;

- пипеткой налить в каждую из пробирок по 9 мл МПБ;

- в первую пробирку влить 1 мл фильтрата бактериофага (разведение 1:10 или 10-1) после чего 1 мл из нее перенести во вторую (разведение 10-2);

- процедуру повторять до 8 пробирки включительно. Из нее для уравнивания объемов 1 мл вылить в дез. раствор;

- 8 пробирка - контроль с МПБ без бактериофага;

- в каждую пробирку ряда налить по 0,5 мл известной тест-культуры;

- поставить в термостат при +37 С на сутки;

- учесть результаты титрования.

2. Постановка реакции нарастания титра фага (РНТФ) осуществляется с известным бактериофагом и его титром. Бактериофаг вносится в анализируемый объем с предполагаемым инфектом. Через сутки контакта из объекта выделяют бактериофаг и определяют его титр. При отсутствии инфекции титр бактериофага падает, при наличии - растет, а РНТФ соответственно отрицательная и положительная.

Практическое применение бактериофагов:

1. Фагодиагностика (фагоиндикация) – выделение бактериофагов из организма больного и объектов внешней среды (косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий).

2. Фагоидентификация – установления вида (фагодифференцировка) и типа (фаготипирование) бактерий (важно для эпидемиологического анализа заболевания – установление

источника и путей распространения заболевания).

3. Фагопрофилактика – применения бактериофагов с целью предупреждения заболеваний в эпидемическом очаге (например, дизентерийный, сальмонеллезный и стафилококковый бактериофаги).

4. Фаготерапия – применение бактериофагов с целью лечения инфекционных заболеваний (например, пиобактериофаг, брюшнотифозный и холерный бактериофаги).

5. Научные исследования.

6. Генная инженерия – использование бактериофагов в качестве векторов.