Секреция продуктов жизнедеятельности бактериальной клеткой

Бактерии синтезируют и секретируют во внешнюю среду различные продукты своей жизнедеятельности, в том числе белки, главным образом ферменты и токсины, с помощью которых они оптимизируют свое существование.

При этом следует различать секрецию белков в периплазматическое пространство через ЦМ и секрецию белков непосредственно в культуральную среду (экскрецию, или экспорт белков). У грамотрицательных бактерий большинство белков секретируется в периплазматическое пространство в виде белков-предшественников, содержащих в своей структуре особый сигнальный (лидерный) пептид из 15 – 40 аминокислотных остатков. Именно он обеспечивает перенос белка-предшественника через ЦМ, после чего и отрезается от него с помощью сигнальной (лидерной) пептидазы.

Существует несколько моделей, объясняющих механизм, посредством которого лидерный пептид обеспечивает секрецию белка-предшественника через ЦМ в периплазматическое пространство.

Модель прямого транспорта предполагает прямое вхождение лидерного пептида в липидный бислой мембраны с использованием свободной энергии мембраноассоциированных рибосом.

Сигнальная гипотеза предполагает, что в результате взаимодействия лидерного пептида непосредственно с особым рецептором мембраны образуется внутримембранный канал, через который и осуществляется секреция.

Большой интерес представляет так называемая система секреции 3-го типа (ССТ3). Она осуществляет секрецию эффекторных белков из цитоплазмы клетки через ЦМ и наружную мембрану непосредственно в клетки растения и животного, с которыми бактерия контактирует. ССТ3 обнаружена у бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia и других и играет у них роль одного из факторов патогенности.

61. Ферменты бактерий. Роль ферментов в патогенности бактерий Идентификация бактерий по ферментативной активности

Ферменты – это высокоспециализированные белки, специфически катализирующие многочисленные химические реакции, происходящие в микробной клетке.

Классификация бактериальных ферментов:

1. По механизму действия:

1) оксидоредуктазы катализируют ОВР (перенос электронов);

2) трансферазы - реакции, идущие с переносом молекул или атомных группировок от одних соединений к другим;

3) лиазы - реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от них H2O, CO2 и NH3;

4) гидролазы - реакции гидролитического расщепления и синтеза органических веществ, идущие с участием H2O;

5) изомеразы осуществляют внутримолекулярные перемещения радикалов и атомов, превращая органические соединения в их изомеры;

6) лигазы (синтетазы) - реакции синтеза сложных органических соединений из простых.

2. По локализации:

· экзоферменты – выделяются наружу, в окружающую среду; расщепляют сложные органические вещества до более простых молекул в процессе питания, которые способны проходить через ЦПМ;

также определяют инвазивность бактерий – их способность проникать через тканевые барьеры;

· эндоферменты функционируют внутри клетки, осуществляя дальнейшее расщепление питательных веществ, а также участвуют в синтезе структур бактериальной клетки.

3. По субстрату воздействия:

• сахаролитические;

• протеолитические;

• липолитические.

4. По концентрации в окружающей среде:

· конститутивные – ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;

· индуцибельные (адаптивные) – ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;

· репрессибельные – ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Ферменты патогенности – ферменты, субстратами для которых являются вещества, входящие в состав клеток и тканей макроорганизма, способствующие проникновению, распространению и размножению микроорганизмов, т.е. проявлению патогенных свойств (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза).

Методы изучения ферментативной активности.

В бактериологической практике для идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов.

Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:

Для многих м/о таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.).

Для обнаружения кислот в среду добавляют реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Ø среды Гисса (пестрый ряд):

Ø жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;

Ø полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты;

Ø короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);

Ø длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).

Ø среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S.

Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

Ø среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным.

У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактозоотрицательных бактерий колонии остаются бесцветными.

Для определения протеолитических ферментов используют:

Ø определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак);

М/о засевают в столбик желатина. Через 3—5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами

Индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;

H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;

Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

О наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.