23. Методы микроскопического исследования (световая, люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная микроскопия)
Методы микроскопического исследования (в том числе и бактериоскопический метод) относятся к методам, основанным на прямом выявлении инфекционных агентов (бактерий, грибов, вирусов, простейших) в живом/инактивированном состоянии или на прямом выявлении его специфичных фрагментов в патологическом материале путем визуализации объекта. С помощью микроскопии исследуют нативный (не поврежденный при исследовании, естественный) материал и/или окрашенный препарат (окрашенный мазок этого материала).
Преимущества микроскопии – быстрота, техническая простота, общедоступность, недорогая стоимость; недостатки – низкая чувствительность, низкая информативность, от врача-клинициста требуются знания техники приготовления препаратов сразу после взятия патологического материала, с помощью микроскопии можно поставить окончательный диагноз только при некоторых заболеваниях: гонорея, туберкулез, возвратные тифы, сифилис, в остальных случаях результаты микроскопии являются предварительными, ориентировочными; достоверность исследования будет зависеть от квалификации микроскописта в связи с субъективной трактовкой препарата (нужна «насмотренность», опыт врача).
Особенности микроскопического исследования влажных препаратов: исследуемый материал НЕ подвергается фиксации, что позволяет обнаружить ЖИВЫЕ микроорганизмы и идентифицировать их по характеру подвижности, морфологическим свойствам; пример: диагноз «сифилис» может быть поставлен с помощью темнопольной микроскопии при обнаружении в отделяемом из твердого шанкра/ в сукровице из розеол подвижных спирохет; так же диагностируются микозы, протозойные инфекции (в т.ч. трихомониаз) и гельминтозы.
*может использоваться при обнаружении клеток, пораженных вирусами – клеток «кошачий глаз» (диагностика цитомегаловирусной инфекции)
Особенности микроскопического исследования окрашенных препаратов: исследуемый материал подвергается фиксации и окрашиванию, что позволяет определить в патологическом материале присутствие микроорганизмов и ориентировочно идентифицировать их на основании морфологических и тинкториальных свойств. Чаще используется окраска по Граму, которая позволяет в ряде случаев поставить этиологический диагноз (менингококковая инфекция, гонорея и др.) или по преобладанию в материале грам+ или грам- флоры выбрать соответствующий антибиотик широкого спектра действия для начала проведения антибактериальной терапии.
*максимальная определяемая концентрация бактерий в мазке из нативного материала - 105 кл./мл (количество микроорганизмов в единице объема исследуемого объекта) (это означает, что при необходимости выявления МО, находящихся в материале в меньших количествах, их предварительно нужно центрифугировать– при туберкулезе, менингококковой инфекции, или делать многослойные мазки, или предобогащение в культуральной среде – при трихомониазе; т.е. патологический процесс может иметь место, но метод не позволит увидеть возбудителей в мазке).
1)Световая микроскопия
Принцип работы: исследуются окрашенные клетки и ткани, для освещения применяются лучи видимого спектра, изображение создается за счет различий и степени поглощения света разными участками изучаемого окрашенного объекта, при прохождении луча через окрашенный объект происходит изменение интенсивности света, человеческий глаз улавливает изменения амплитуды световой волны.
Достоинства: техническая простота, недорогая стоимость, позволяет различить структуру и детали изучаемого объекта, если он состоит из частей с разной оптической плотностью без специальных доп. устройств
Недостатки: низкий контраст изображения, не видны объекты менее 200 нм
*окраска по Цилю-Нильсену используется для дифференцировки бактерии по строению клеточной стенки
2) Люминесцентная микроскопия
Принцип работы: мощный пучок света (из источника света, богатого ультрафиолетом) попадает на систему ультрафиолетовых светофильтров, фиолетовые и ультрафиолетовые лучи проходят через фильтр и, пройдя по оптической системе, попадают (фиолетовые на рисунке) на интерференционный светофильтр (серый на рисунке), расположенный над объективом под углом 450. Последний не пропускает УФ-лучи и отражает их в объектив. Через объектив происходит освещение объекта, ранее окрашенного флюорохромом, возникает вторичная флюоресценция. Лучи вторичной флюоресценции (зеленым на рисунке) НЕ задерживаются интерференционным светофильтром и попадают в окуляр.
Достоинства: высокая контрастность, возможность использования специфичных методов микроскопии (реакция иммунофлюоресценции).
Недостатки: высокая стоимость.
3) Темнопольная микроскопия
Принцип работы: в микроскопе используется кардиоид-конденсор (или параболоид-конденсор), который не пропускает центральные лучи, для освещения используются боковые лучи, которые при отсутствии объекта не попадают в объектив (темное поле). При наличии объекта часть лучей, попадая на него, отражается в объектив, создавая яркое изображение.
Достоинства: возможность изучения живых микроорганизмов (изучения подвижности бактерий и простейших); отсутствие искажений, связанных с фиксацией и окраской препаратов.
Недостатки: сложная настройка освещения, высокие требования к качеству предметных и покровных стекол.
4) Фазово-контрастная микроскопия
Принцип работы: пучок света, проходящий сквозь неокрашенный препарат, меняет фазу колебания световой волны, но это колебание не воспринимается человеческим глазом. Фазово-контрастный конденсор и фазовый объектив делают изображение контрастным, превращая фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные.
Достоинства: возможность изучения живых микроорганизмов (изучение подвижности бактерий и простейших); отсутствие искажений, связанных с фиксацией и окраской препаратов, возможно изучение внутренней структуры крупных объектов (ядра, вакуоли).
*нужен для изучения малоконтрастных объектов, невидимых в микроскоп при наблюдении в проходящем свете в световом поле
Недостатки: слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов.
5) Электронная микроскопия
эпителий трахеи (РЭМ – растровая) Поперечное сечение через жгутики хламидомонады (ПЭМ – просвечивающая, или трансмиссионная)
Принцип работы:
1)сканирующая (растровая) ЭМ используется для изучения поверхности объекта, образцы покрываются пленкой металла, вместо света через объект пропускается пучок электронов; 2)трансмиссионная (просвечивающая) ЭМ используется для изучения внутреннего строения клетки, пучок электронов пропускается через объект, предварительно обработанный тяжелыми металлами, которые накапливаются в определенных структурах, увеличивая их электронную плотность, электроны рассеиваются на участках клетки с большей электронной плотностью, в результате чего на изображениях эти области выглядят темнее.
Достоинства: высокое разрешение (теоретически до 0,002 нм, практически до 2 нм), возможность изучения ультраструктур клеток
Недостатки: необходимо специальное техническое оснащение, техническая сложность, труднодоступность, дороговизна
*ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ:
Увеличение (увеличительная способность оптической системы) – то, во сколько раз можно увеличить объект при сохранении четкости изображения. Рассчитывается как произведение объектива на увеличение окуляра.
Разрешение (разрешающая способность) – минимальное расстояние между двумя точками, на котором они еще воспринимаются отдельно. Разрешение здоровой оптической системы глаза 0,2 мм.
Для микроскопии готовят мазки (микропрепараты):
1) нативный – в физ.раствор на предметное стекло наносят суспензию исследуемого материала, покрывают сверху покровным стеклом;
2) фиксированный – обезжиривают предметное стекло, наносят каплю физ.раствора, петлей/зубочисткой/стеклянной палочкой готовят суспензию исследуемого материала, высушивают, фиксируют в пламени спиртовки или хим. веществом, окрашивают, промывают, высушивают.