10. Внутривидовое типирование бактерий. Методы. Использование в практике

С целью выявления эпидемической цепочки заболевания, в том числе для обнаружения источника инфекции, осуществляют внутривидовую идентификацию бактерий, которая заключается в определении фаготипа (фаговара), изучении антигенных и других свойств выделенных бактерий. Определение фаготипа - фаготипирование производят при стафилококковой инфекции, брюшном тифе, паратифе В.

Фаготипирование — один из методов эпидемиологического маркирования. Применяется для выявления источника инфекции. Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. Предварительно фаготируется.

При внутривидовой идентификации бактерий, т. е. при определении фаговара (фаготипа) бактерий с помощью фаготипирования, на чашку с плотной питательной средой, засеянную чистой культурой возбудителя в виде «газона», наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Бактерии, чувствительные к фагу, лизируются (образуется стерильное пятно, «бляшка» или так называемая негативная колония фага).

На засеянные «газоном» стафилококки наносятся капли взвеси стафилококковых бактериофагов. Через сутки после инкубации в термостате видны стерильные зоны отсутствия роста бактерий (стерильные «бляшки») в результате размножения бактериофагов, вызывающих лизис этих бактерий.

Фаготипирование стафилококков:

Дно чашки Петри с МПА делят на квадраты, каждый из которых подписывают цифрами, соответствующими номерам типовых стафилофагов. На подготовленную чашку газоном засевают исследуемый штамм S.aureus и в каждый квадрат капают соответствующий типовой стафилофаг. Засеянную чашку с культурой и бактериофагами помещают в термостат. На другой день учитывают результат фаготипирования, отмечая номера типовых стафилофагов, лизировавших культуру (в соответствующих квадратах будут видны "стерильные пятна"). Фаготип - перечень типовых бактериофагов, лизировавших данную культуру. Это - один из приемов внутривидового типирования, позволяющий установить источник инфекции и пути распространения.

Титрование вируса полиомиелита в цветной пробе Солка:

В пробирках находится вируссодержащий материал в соответствующих разведениях и культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

В контрольной пробирке содержится только культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

Штатив помещают в термостат. Просматривают ежедневно. После того как в контрольной пробирке цвет среды изменится с красного на желтый, что свидетельствует о том, что культура клеток жива, штатив извлекают из термостата и учитывают результат. Титром вируса является наибольшее разведение, в которой произошла гибель клеток и цвет среды поэтому не измененился, остался красным.

11. Врожденный иммунитет. Фагоцитоз. Показатели фагоцитоза

Существует врожденный и приобретенный иммунитет к возбудителям инфекционных заболеваний.

Врожденный:

а) видовая невосприимчивость; б) неспецифическая резистентность Приобретенный: а) естественный (активный, пассивный) б) искусственный (активный, пассивный)

Врожденный иммунитет — выработанная в процессе филогенеза генетически закрепленная, передающаяся по наследству невосприимчивость данного вида к какому-либо антигену (или микроорганизму), обусловленная биологическими особенностями самого организма, свойствами данного антигена, а также особенностями их взаимодействия.

Врожденная невосприимчивость включает в себя видовую невосприимчивость и неспецифическую резистентность.

Видовая невосприимчивость – это генетически закрепленная невосприимчивость одного вида животных к возбудителю, вызывающему инфекционное заболевание у другого вида (например, человек не болеет чумкой собак и кошек, а крысы не болеют дифтерией, гонореей, дизентерией).

Причины видовой невосприимчивости:

· различия в температуре тела у животных разных видов;

· отсутствие факторов роста в инфицируемых тканях;

· отсутствие рецепторов для адгезии.

Видовая невосприимчивость бывает абсолютной (ни при каких обстоятельствах нельзя воспроизвести инфекционное заболевание) и относительной (при определенных условиях можно привить болезнь, так, например, у кур, обладающих невосприимчивостью к сибирской язве, можно вызвать данное заболевание путем понижения температуры тела).

Неспецифическая резистентность – способность организма противостоять действию чужеродных агентов стереотипными механизмами, выработанными в процессе многовековой эволюции.

Фагоцитоз – клеточный (тканевой) фактор неспецифической резистентности

Фагоцитоз – процесс активного поглощения специализированными клетками организма попадающих в него живых или убитых микроорганизмов и различных инородных частиц с последующим их перевариванием при помощи внутриклеточных ферментов.

Клетки, участвующие в фагоцитозе (фагоциты):

1. Макрофаги:

· моноциты периферической крови;

· тканевые макрофаги/клетки РЭС – купферовские клетки печени, мезангиальные клетки почек, гигантские эпителиоидные клетки воспалительных очагов и др.;

2. Микрофаги (гранулоциты):

· нейтрофилы;

· базофилы;

· эозинофилы.

Функции фагоцитоза:

· защита от инородных частиц;

· рассасывание гематом;

· поглощение нежизнеспособных клеток самого организма и продуктов клеточного распада.

Стадии фагоцитоза:

1. Хемотаксис – целенаправленное движение фагоцитов в сторону фагоцитируемого объекта.

К хемоатрактантам (стимуляторам хемотаксиса фагоцитов) относятся продукты деградации тканей организма, лимфокины, бактериальные компоненты, комплемент (С3в, С5а, С5в, С6, С7).

1. Адгезия (аттракция) – прикрепление/абсорбция на мембране фагоцита.

2. Поглощение путем эндоцитоза с образованием вакуоли (фагосомы) с заключенными в ней поглощенными частицами.

3. Образование фаголизосомы (пищеварительной вакуоли) – к фагосоме устремляются лизосомы и сливаются с ней, лизосомальные ферменты изливаются в образовавшуюся фаголизосому.

4. Переваривание поглощенных объектов внутри фаголизосом с помощью суперактивных кислородных радикалов (Н2О2, атомарный кислород и др.), лизосомальных катионных белков и гистонов, клеточных протеаз, пептидаз и прочих ферментов.

5. Экзоцитоз.

Фагоцитоз может быть завершенным и незавершенным.

Завершенный фагоцитоз – фагоцитоз, при котором поглощенные фагоцитами бактерии погибают и разрушаются, т.е. полностью перевариваются.

Незавершенный фагоцитоз – фагоцитоз, при котором не происходит переваривания поглощенных частиц или оно происходит не до конца.

Причины незавершенности фагоцитоза:

· резистентность к лизосомальным ферментам за счет наличия капсулы или плотной гидрофобной клеточной стенки (например, гонококки и сатафилококки);

· способность блокировать слияние фагосом и лизосом (например, микобактерии).

Многие внутриклеточные паразиты не только сохраняют жизнеспособность внутри фагоцитов, но и способны там размножаться.

Факторы, стимулирующие (опсонизирующие) процесс фагоцитоза:

· специфических антитела (Ig G и M);

· комплемент (С3, С3b, С4b);

· лизоцим;

· интерлейкины (ИЛ-5);

· белки острой фазы.

На практике фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови определяется с целью оценки иммунного статуса человека.

Показатели активности фагоцитоза:

Ø (ФИ) Фагоцитарный индекс (фагоцитарная активность) – процент лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе (норма для взрослых 65-95%).

Ø Фагоцитарный число (ФЧ) – среднее количество частиц, поглощенных одним фагоцитом (норма: 5-10 микробных частиц)

Ø Индекс завершенности фагоцитоза – процент частиц, переваренных за определенное время одним фагоцитом.

Ø НСТ-тест (нитросиний тетразолий) – способность лейкоцитов восстанавливать бесцветный реактив (нитросиний тетразоль) в краситель, окрашивающий их в синий цвет (N=48-80%). Отражает способность нейтрофилов к уничтожению бактерий в пристутствии активных форм кислорода

Ø Опсонофагоцитарный индекс – отношение ФИ иммунной сыворотки (сыворотки, содержащей опсонины) к ФИ нормальной (неиммунной) сыворотки.

12. Геном бактерий. Хромосома, нехромосомные элементы генома. Подвижные элементы генома и их роль в изменчивости бактерий

Характеристика генетического аппарата бактерий Организация генома.

Генетический аппарат бактерий представлен бактериальной хромосомой, внехромосомными факторами наследственности – плазмидами, а также входящими в их состав мобильными генетическими элементами. Жизненно важная генетическая информация бактерий сосредоточена в располагающейся непосредственно в цитоплазме единственной хромосоме, что позволяет отнести бактерии к гаплоидным организмам. Возможны некоторые исключения, например, Vibrio cholerae содержит две кольцевидные хромосомы

Несмотря на весьма значительную разницу в сложности организации фенотипа прокариот и эукариотических организмов, различие в количестве генов не велико. Для объяснения этого феномена в последнее время получила развитие концепция сетевых взаимодействий: дело не в различии в количестве генов, а в сложности генетических сетевых взаимодействий.

Бактериальная «хромосома», как правило, представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК, спирализованной и свернутой в кольцо, в одной точке прикрепленное к ЦПМ; кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Prokaryotae варьируют от 3 х 108 до 2,5 х 109 Д.

Одну кольцевую «хромосому» имеет также ряд других бактерий: Shigella spp, Salmonella spp, P. aeruginosa, B. subtilis. Однако такое строение генома не является универсальным. У некоторых бактерий, в частности у V. cholerae, L. interrogans, Brucella spp., имеется две кольцевых хромосомы. У ряда других бактерий (Borrelia burgdorferi, Streptomyces spp.) обнаружены линейные хромосомы

Плазмиды – это внехромосомные факторы наследственности, представляющие собой небольшие кольцевые двухцепочечные суперскрученные ковалентнозамкнутые молекулы ДНК, которые располагаются в цитоплазме и способны к автономной репликации. В плазмидах закодирована информация, необходимая для репликации плазмид в бактериях, а также информация о дополнительных признаках, сообщающих бактериям преимущества в тех или иных условиях обитания и в стрессовых ситуациях. В одной клетке может быть несколько плазмид, совокупность которых называют плазмотипом.

Плазмиды могут интегрировать в бактериальную хромосому, тогда их называют эписомами. Репликация плазмид начинается со связывания с итероном (место старта репликации) инициирующего репликацию белка.

Плазмиды классифицируют на несколько групп в зависимости от:

Ø 1 Размера: большие, средние, малые (космиды).

Ø 2 Способности вызывать конъюгацию бактерий:

Ø -----конъюгативные, которые имеют относительно большие размеры и содержат информацию, необходимую для автономной репликации и переноса ДНК реципиенту;

Ø -----неконъюгативные, которые не способны запускать конъюгацию; они могут передаваться реципиенту при наличии в клетке конъюгативных плазмид.

Ø 3 Способности к репликации в одной клетке: совместимые и несовместимые.

Ø 4 Кодируемого фенотипического эффекта:

a) Фертильности – F-плазмиды.

б) Бактериоциногении – Сol-плазмиды (ColE1, ColE2). Кодируют продукцию бактериоцинов – антибиотикоподобных веществ, обладающих бактерицидным действием в отношении близкородственных видов микроорганизмов. Обуславливают устойчивость или множественную устойчивость к антибиотикам, солям 10 тяжелых металлов, УФ излучению

Как правило, являются конъюгативными. Состоят из двух участков:

· фактора переноса устойчивости, или RTF, содержащего гены репликации и переноса в клетку реципиента;

· R-детерминанты, содержащей гены или транспозоны резистентности.

Плазмиды участвуют в генетических перестройках, обеспечивают горизонтальный перенос генов, используют в качестве векторов в генной инженерии.

Различают два класса подвижных элементов: транспозоны и рет­ротранспозоны. Та­кая классификация основана на механиз­мах, с помощью которых перемещаются подвижные элементы.

Транспозоны перемещаются с участием комплекса белков, обеспечиваю­щего активность фермента транспозазы, которая узнает элемент и обеспечивает его перенос на новое место. Транспозоны ограничены с двух сторон ин­вертированными по­вторами, то есть последовательностями, направленными навстречу друг другу. Инвертированные повторы сближаются и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина.

Вырезанный транспозон внедряется в район вносимого транспозазой разрыва в молекуле-мишени и сшивается с ДНК хо­зяина в новом месте. Подвижность элементов становится возможной благодаря активно­сти ферментов, кото­рые способны точно вырезать элемент из хромосомы для того, чтобы затем вставить его в другое место генома. Брешь в ДНК, оставляемая после вырезания транспозона, может зале­чиваться с участием гомологичного участка, например сестринской молекулы ДНК.

Рет­ротранспозоны не умеют вырезаться из хромосомы, как это делают транспозоны. Механизм их перемещения осно­ван на реакции обратной транскрипции - синтеза нити ДНК на РНК. Химическая реакция протекает так же, как при об­разо­вании нити комплементарной ДНК на ДНК-матрице при репликации двух­нитевой молекулы ДНК. Обратная транскрипция была обнаружена при изуче­нии ретровирусов, содержащих РНК. Фермент, осуществляющий реак­цию синтеза ДНК на РНК, называют об­ратной транскриптазой или ревертазой. Ревертаза ведет синтез нити ДНК на РНК и осуществляет синтез второй ком­плементарной нити ДНК, а РНК-матрица распадается и удаляется. Двухнитевая ДНК синтезируется в цитоплазме, а затем перемещается в ядро и может встро­иться в геном, образуя провирус. Находясь в хромосоме, провирус наследуется в ряду поколений как обычный ген.

Ретротранспозоны распро­странены у эукариот, населяя геномы дрожжей, растений, насекомых, позво­ночных и человека. Процесс синтеза ДНК при размноже­нии ретротранспозона с участием ревертазы происходит в вирусоподобных частицах. Но частицы неинфекционные, т. к. большая часть ретротранспозонов не содержит гена, кото­рый кодирует белок оболочки вирусной частицы, обеспечивающей ее выход из клетки и способность к заражению других клеток. Ретротранспозоны пред­ставляют собой внутригеномные, неинфекционные эле­менты, способные к самовоспроизведению и "подзаражению" того же генома. Другой класс ретротранспозонов не несет длинных концевых по­второв. Механизм внедрения осуществляется с помощью об­ратной транскрипции. К числу таких рет­ротранспозонов относятся представители семейства L1, насе­ляющие геном человека.

13. Гиперчувствительность замедленного типа. Кожно-аллергические пробы и их использование в диагностике некоторых инфекционных заболеваний.

К аллергическим реак­циям относят два типа реагирования на чужеродное вещество: гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). К ГНТ относятся аллергические реакции, проявляющиеся уже че­рез 20—30 мин после повторной встречи с антигеном, а к ГЗТ — реакции, возникающие не ранее чем через 24—48 ч. Механизм и кли­нические проявления ГНТ и ГЗТ различны. ГНТ связана с вы­работкой антител, а ГЗТ — с клеточными реакциями.

ГЗТ впервые описана Р. Кохом (1890). Эта форма проявления не связана с антителами, опосредована клеточными механизма­ми с участием Т-лимфоцитов. К ГЗТ относятся следующие фор­мы проявления: туберкулиновая реакция, замедленная аллергия к белкам, контактная аллергия.

В отличие от реакций I, II и III типов реакции IV типа не свя­заны с антителами, а обусловлены клеточными реакциями, прежде всего Т-лимфоцитами. Реакции замедленного типа могут возникать при сенсибилизации организма:

1. Микроорганизмами и микробными антигенами (бактериальны­ми, грибковыми, протозойными, вирусными); 2. Гельминтами; 3. Природными и искусственно синтезированными гаптенами (лекарственные препараты, красители); 4. Некоторыми белками.

Следовательно, реакция замедленного типа может вызывать­ся практически всеми антигенами. Но наиболее ярко она про­является на введение полисахаридов, низкомолекулярных пеп­тидов, т. е. малоиммуногенных антигенов. При этом реакцию вызывают малые дозы антигенов и лучше всего при внутрикожном введении.

Механизм аллергической реакции этого типа состоит в сен­сибилизации Т-лимфоцитов-хелперов антигеном. Сенсибилизация лимфоцитов вызывает выделение медиаторов, в частности интерлейкина-2, которые активируют макрофаги и тем самым вов­лекают их в процесс разрушения антигена, вызвавшего сенсибилизацию лимфоцитов. Цитотоксичность проявляют также и сами Т-лимфоциты. О роли лимфоцитов в возникновении аллер­гий клеточного типа свидетельствуют возможность передачи ал­лергии от сенсибилизированного животного несенсибилизированному с помощью введения лимфоцитов, а также подавление реакции при помощи антилимфоцитарной сыворотки.

Морфологическая картина при аллергиях клеточного типа но­сит воспалительный характер, обусловленный реакцией лимфо­цитов и макрофагов на образующийся комплекс антигена с сен­сибилизированными лимфоцитами.

Аллергические реакции клеточного типа проявляются в виде туберкулиновой реакции, замедленной аллергии к белкам, кон­тактной аллергии.

Туберкулиновая реакция возникает через 5—6 ч после внутрикожного введения сенсибилизированным туберкулезной палоч­кой животным или человеку туберкулина, т. е. антигенов тубер­кулезной палочки. Выражается реакция в виде покраснения, при­пухлости, уплотнения на месте введения туберкулина. Сопровож­дается иногда повышением температуры тела, лимфопенией. Раз­витие реакции достигает максимума через 24—48 ч. Туберкули­новая реакция используется с диагностической целью для вы­явления заболеваний туберкулезом или контактов организма с туберкулезной палочкой.

Замедленная аллергия возникает при сенсибилизации малы­ми дозами белковых антигенов с адъювантом, а также конъю-гатами белков с гаптенами. В этих случаях аллергическая реак­ция возникает не раньше чем через 5 дней и длится 2—3 нед. Видимо, здесь играют роль замедленное действие конъюгированных белков на лимфоидную ткань и сенсибилизация Т-лимфо-цитов.

Контактная аллергия возникает, если антигенами являются низкомолекулярные органические и неорганические вещества, которые в организме соединяются с белками, образуя конъюга-ты. Конъюгированные соединения, выполняя роль гаптенов, вы­зывают сенсибилизацию. Контактная аллергия может возникать при длительном контакте с химическими веществами, в том числе фармацевтическими препаратами, красками, косметичес­кими препаратами (губная помада, краска для ресниц). Прояв­ляется контактная аллергия в виде всевозможных дерматитов, т. е. поражений поверхностных слоев кожи.

Значение. Все реакции гиперчувствительности, в том числе и ГЗТ имеют большое значение. Их механизмы лежат в основе воспаления, которое способствует локализации инфекционного агента или иного антигена в пределах определённых тканей и формированию полноценной иммунной реакции защитного характера.