41. Криптококкоз. Возбудители. Лабораторная диагностика криптококкоза
Возбудитель криптококкоза
Возбудителем криптококкоза (европейский бластомикоз, болезнь Буссе-Бушке) является дрожжевой гриб Cryptococcus neoformans. Телеоморфа С. neoformans находится в отделе Basidiomycota. Выделяют два биовара возбудителя: С. neoformans var. neoformans и С. neoformans var. gattii, имеющих разные телеоморфы.
Экология и эпидемиология.
Заболевание распространено повсеместно, но случаи криптококкоза, вызванного С. neoformans var. gattii, встречаются, в основном, в субтропическом и тропическом климате Африки и Юго-Восточной Азии.
Природный источник С. neoformans var. neoformans - почва, содержащая помет голубей, реже гниющие овощи, фрукты, растения. Заболевание встречается у грызунов, домашнего скота, кошек, собак. Птицы не болеют криптококкозом, возможно из-за более высокой температуры тела. С. neoformans var. gattii не выделяется из почвы или помета птиц. Заболевание встречается в тех областях с жарким и влажным климатом, где растут деревья красного эвкалипта.
Заражение происходит при вдыхании содержащихся в пыли мелких клеток гриба, лишенных капсулы, а возможно и базидиоспор совершенной формы. Возможно заражение и другими путями: через поврежденную кожу или слизистые оболочки. Надежного скринингового теста для диагностики криптококкоза нет, поэтому точные сведения о заболеваемости криптококкозом, с учетом стертых форм, отсутствуют.
Морфология и физиология
На агаре Сабуро в стандартных условиях С. neoformans растет медленно, созревает в течение недели. При температуре 30-37oС многие штаммы созревают за 3-4 сут. Колонии С. neoformans плоские или слегка выпуклые, влажные, блестящие, с гладкими краями, вначале кремовые, затем светло-коричневые.
При микроскопии обнаруживают круглые, дрожжевидные почкующиеся клетки. Морфология исследуется на кукурузном агаре, где обнаруживают круглые, размером 4-8 мкм, почкующиеся клетки С. neoformans с толстыми темными стенками.
Для рода Cryptococcus характерны следующие признаки: образование капсулы, отсутствие мицелия, способность ассимилировать инозитол и уреазная активность. Cryptococcus spp. не ферментируют сахара.
Факторы патогенности.
Главным фактором патогенности является мукополисахаридная капсула. С ее помощью возбудитель противостоит фагоцитозу, и подавляет образование ряда цитокинов, в частности фактора некроза опухолей. Кроме того, С. neoformans образует фермент, которого нет у всех остальных болезнетворных грибов: фенолоксидазу, также считаемую фактором патогенности.
Патогенез и иммунитет
Больных криптококкозом можно разделить на две группы: с иммунодефицитом (в основном это ВИЧ-инфекция) и внешне здоровые лица. У последних заболевание часто протекает благоприятно, имеет стертую клиническую картину. Криптококкоз считается СПИД-индикаторным заболеванием.
Защита организма от криптококковой инфекции представлена прежде всего клеточным иммунитетом (Т-лимфоциты и макрофаги). Поэтому тяжелые и диссеминированные формы криптококкоза встречаются у больных с клеточным иммунодефицитом: при ВИЧ-инфекции, и у пациентов, получающих кортикостероидные и цитостатические препараты, при лимфомах, саркоидозе, аутоиммунных заболеваниях.
В начале заболевания происходит инвазия легких, с развитием пневмонии. Обычно пневмония характеризуется благоприятным течением и проходит самостоятельно, но у больных с иммунодефицитом нередко развивается хроническое поражение легких, или происходит гематогенная диссеминация возбудителя, чаще всего в головной мозг, иногда в кожу или кости, еще реже - другие органы. Характерным для поражения ЦНС является длительно протекающий менингит. При отсутствии терапии больные умирают от отека мозга через несколько месяцев.
Лабораторная диагностика
Материалом для исследования служат цереброспинальная жидкость, мокрота и бронхиальные смывы, кровь, моча, экссудат из кожных очагов, биопсированная ткань. Диагноз криптококкоза ставится при обнаружении окруженных капсулой дрожжевых клеток в патологическом материале или ткани, при выделении возбудителя из любой локализации. Цереброспинальную и другие жидкости, мокроту и экссудат окрашивают тушью или нигрозином, чтобы обнаружить капсулу гриба. Перед исследованием мокроты или гноя их следует обработать в 10 % растворе едкого кали. Обнаруживают круглые или овальные, окруженные толстой, толще, чем сами клетки, капсулой. При обычной окраске капсулу можно не заметить из-за ее прозрачности.
Чтобы отличить С. neoformans от других видов Cryptococcus при выделении культуры, а также в целях быстрой идентификации выявляют фенолоксидазную активность на средах с птичьим кормом или кофеиновой кислотой. Для идентификации С. neoformans разработан метод, использующий гибридизацию ДНК. Для дифференцирования С. neoformans var. neoformans от С. neoformans var. gattii, используют среду с L-канаванином-глицином и бромтимолом, а также способность С.neoformans var. gattii ассимилировать D-пролин и образовать продолговатые сигаровидные клетки.
Иммунологическая диагностика.
Иммунологическая диагностика криптококкоза основывается на обнаружении полисахаридного (глюкуроксилманнанового) антигена капсулы, поскольку антитела к криптококкам обнаруживаются только на ранней стадии заболевания. Для обнаружения антигена исследуют спинномозговую жидкость и кровь, а также мочу. Используются тесты латекс-агглютинации и иммуноферментный.
Лечение и профилактика.
В лечении криптококкоза используют амфотерицин В (в том числе его липосомальную форму «амбизом»), флуконазол, флуцитозин, итраконазол и различные комбинации этих препаратов.
42. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза. Эпидемиология. Механизмы действия основных противотуберкулезных препаратов и механизмы возникновения устойчивости к ним. Лабораторная диагностика
Лекарственная устойчивость микобактерий – актуальная проблема нынешнего времени. В связи с широким использованием АБ препаратов в терапии у микобактерий развивается к ним резистентность.
Эпидемиология.
Туберкулез распространен повсеместно. Основной источник – больной человек. При туберкулезе легких в 50% случаев отмечается выделение возбудителя во внешнюю среду. Заражение чаще всего происходит при прямом, длительном и тесном контакте здорового человека с больным. Основным механизмом заражения является аэрогенный, а входными воротами – органы дыхания. Пути заражения туберкулезом - воздушно-капельный и воздушно-пылевой. Иногда наблюдается заражение контактно-бытовым путем через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки при использовании предметов больного человека.
Резистентность: высокая, за счет особенностей клеточной стенки – большое содержание липидов и восковой слой. В мокроте – до пяти месяцев. На предметах больного сохраняются также в течение нескольких месяцев. Сохраняются в почве и в воде, при кипячении погибают через 5-7 минут. В пыли пребывают до нескольких дней (до 10). Солнечный свет вызывает их гибель через 1,5 часа, УФЛ – через 2-3 минуты. Устойчивы к действию низких температур, обычных дезинфицирующих средств.
Основным механизмом формирования лекарственной резистентности является селекция мутантов и их адаптация. Резистентность может носить как хромосомный, так и плазмидный характер. Устойчивость также может определяться действием инсерционных (IS) последовательностей. Такие последовательности не несут дополнительной информации, кроме той, которая необходима для их транспозиции. Перемещаясь, они могут изменять функционирование гена, «включать» или «выключать» последовательности, координировать действие других подвижных генетических элементов.
Биохимические механизмы являют собою:
Различают следующие виды лекарственной резистентности у микобактерий:
· Монорезистентность – устойчивость к одному из противотуберкулезных препаратов;
· Полирезистентность – устойчивость к двум и более препаратам;
множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – устойчивость к изониазиду и рифампицину одновременно, независимо от наличия устойчивости к другим препаратам;
· Суперустойчивость (XDR) – множественная лекарственная устойчивость в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и одному из инъекционных препаратов (канамицин, амикацин, капреомицин)
· Перекрестная устойчивость – возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим препаратам внутри одной группы.
По происхождению различают первичную и приобретенную лекарственные резистентности: первичной считаются штаммы, выделенные от пациентов, не получавших лечения в течение месяца или более, приобретенной же, соответственно – резистентность, развившаяся на фоне проводимой терапии продолжительностью менее месяца.
Лечение.
1. Препараты первого ряда – изониазид, рифампицин, стрептомицин, пиразинамид, этамбутол. Это препараты выбора, используемые в первую очередь.
2. Препараты второго ряда – этионамид, циклосерин, капреомицин, канамицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, амикацин, протионамид. Используются при лекарственной резистентности
3. Резервные препараты – рифабутин, клофазимид, кларитромицин, амоксициллин, фтивазид, флуренизид, тиацитазон.
Самой высокой активностью обладают изониазид и рифампицин
Изониазид - ингибирует синтез миколовых кислот, важного компонента клеточной стенки обеспечивающего патогенность микобактерий),
Рифампицин (антибиотик, ингибирующий РНК-полимеразу (ингибирование транскрипции РНК))
Стрептомицин ингибирует синтез белков, присоединяясь к 30S субъединице рибосом.
Этамбутол, пиразинамид – бактериостатическое действие, (Видаль их механизмов не ведает)
Для уменьшения вероятности возникновения лекарственной резистентности применяют четырех- и пятикомпонентные схемы лечения, включающие препараты с разными механизмами действия. Общими механизмами действия при этом считаются действие на клеточную стенку, на синтез АТФ и белка.
Диагностика.
Для лабораторной диагностики туберкулеза применяют практически все доступные методы исследования.
Основными методами диагностики туберкулеза являются:
- бактериоскопический метод (световая и люминесцентная микроскопия);
- бактериологический метод.
Дополнительными методами диагностики туберкулеза являются:
- биологический метод;
- серологический метод;
- кожные аллергические пробы;
- ПЦР
Материал для исследования: мокрота, отделяемое из бронхов, свищей, спинномозговая жидкость (СМЖ), моча, испражнения.
Бактериоскопический метод: готовятся мазки, которые окрашивают по методу Циля-Нильсена или флюорохромом, для дальнейшего люминесцентного микроскопирования.В результате исследования в препаратах обнаруживают единичные кислотоустойчивые бактерии. Если концентрация бактерий невеликатогда для их обнаружения используют методы обогащения: центрифугирование и флотацию. Метод центрифугирования подразумевает обработку щелочью с последующим центрифугированием, осадок же микроскопируют. Метод флотации: также начинается с обработки (смесью щелочи и бензола). Пробу встряхивают, а образующаяся пена выносит микобактерии на поверхность. Готовят препарат из пены. При микроскопии неоходимо проводить количественный учет результатов, т.к. количество видимых бактерий прямо соотносится с тяжестью заболевания.
Используется также метод люминесцентной микроскопии. В окуляре микроскопа – светящиеся бактерии, похожие на мицелий грибов
Бактериологический метод: микобактерии весьма требовательны к средам. Для их роста необходимы глицерин, сыворотка крови, яичный желток, факторы роста (витамины группы Б), электролиты.
Материал обрабатывают раствором кислоты, отмывают, высевают на плотные питательные среды и выращивают в течение 2-12 недель.
Опасность культуры определяется по наличию корд-фактора – фактора патогенности микобактерий, являющегося по совместительству миколовой кислотой и компонетом клеточной стенки. При наличии оного при микроскопировании обнаруживаются «жгуты» бактерий.
Существует ускоренный метод культивирования, метод по Прайсу. Материал также обрабатывают, промывают и высеивают на среду с кровью, где культивируют 3-4 дня и окрашивают по Цилю-Нильсену. В окуляре – красные жгуты
Для выращивания микобактерий рекомендуются яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2 (шороховатые плотные неровные колонии цвета слоновой кости), а также глицериновые агаровые среды Миддлбрука.
Биологический метод – введение обработанного материала лабораторным животным, тем же морским свинкам, и наблюдение за развитием симптомов туберкулеза.
Аллергические пробы: применяются для определения повышенной чувствительности к туберкулину, возникающей в случае инфицирования или после специфической вакцины.
Из микобактерий туберкулеза получают т.н. сухой очищенный туберкулин, PPD (белковый очищенный дериват). Вводят накожно, внутрикожно в зависимости от реакции
В настоящее время в основном используется проба Манту. Туберкулин вводят внутрикожно, и через 24-72 часа смотрят реакцию. При положительном результате на месте введения образуется небольшой очаг воспаления из-за скопления лимфоцитов, уже сенсибилизированных возбудителем туберкулеза.
Также, из недавнего – диаскинтест, в этом случае внутрикожно вводятся рекомбинантные белки.
Серологические методы: (НЕ ОСНОВНОЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ) включают:
- РСК, РА, РПГА, РНГА;
- ИФА;
- РИФ с моноклональными антителами.
Также может использоваться ПЦР-реакция.