24. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Мпк (мик) и мбк. Критерии определения бактериальных изолятов как чувствительные, устойчивые, умеренно чувствительные
МПК – минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.
МБК – минимальная бактерицидная концентрация – минимальная концентрация антимикробного препарата, вызывающая при исследовании in vitro полную гибель бактерий в стандартных условиях опыта.
Хорошие лекции:
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ
Определение чувствительности выделенных культур возбудителя к антибиотикам, является необходимым элементом бактериологического исследования и обязательным условием антибиотикотерапии.
А. Метод стандартных бумажных дисков.
Величины зон задержки роста:
· диаметр от 0 мм до 6 мм – устойчивые;
· диаметр от 7 до 15мм – слабочувствительные;
· диаметр от 16 мм до 24 мм – чувствительные;
· диаметр от 25 мм и более – высокочувствительные.
Метод дает только качественную характеристику, однако прост и доступен в исполнении.
Б. Метод серийных стандартных разведений – позволяет определять минимальную подавляющую (ингибирующую) концентрацию антибиотика.
В. Экспрессный рэдокс-метод – основан на улавливании изменения ОВП питательной среды микроорганизмами по изменению цвета индикатора, добавленного в питательную среду (подолжительность определения 3-5 часов).
Д. ПЦР – выявление у микроорганизма генов устойчивости.
Г. Е-тест – применяют бумажные полоски, пропитанные рядом убывающих концентраций определённого антибиотика (128, 64, 32, 16, 8... мкг/мл), после инкубирования вокруг полоски образуется эллипсовидная зона задержки роста.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБИОТИКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
Для определения концентрации антибиотиков в моче, крови и других биологических жидкостях используют метод, основанный на способности антибиотиков диффундировать в агар, зараженный тест-микробом и подавлять рост последнего. Зона подавления роста тест-микроба зависит от концентрации антибиотика в изучаемом субстрате. Диаметры полученных зон сравнивают с величиной зон, образующихся при нанесении на агар известных количеств стандартного препарата (стандартами служат специально приготовленные очищенные образцы антибиотиков, активность которых установлена по международным стандартам).
Зверев:
Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:
• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.
• Методы определения минимальных ингибирующих (МИК) и бактерицидных концентраций (МБК), т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.
· Молекулярно-генетические методы (ПЦР и др) позволяет исследовать геном микробов и обнаружить гены резистентности
· Метод пограничных значений (мудл)
· Метод разведений в жидкой среде (мудл)
· Метод градиентных полосок (Е-тест) (мудл)
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков.
Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.
Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.
На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня.
По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.
Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.
Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин).
Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.
Мудл:
После наложения диска на засеянную "газоном" культуру начинается диффузия препарата в агар, при этом его концентрация в агаре уменьшается по мере удаления от диска. Испытуемая культура может расти на агаре только там, где концентрация антибиотика не подавляет ее роста. Вокруг диска образуется зона задержки роста, коррелирующая с устойчивостью (чувствительностью) штамма к препарату.
Диаметры зон задержки роста содержатся в оценочных таблицах и позволяют разделить штаммы на чувствительные (S), устойчивые (R) и промежуточные (I).
Достоинства метода
· Простота постановки теста и учета результатов
· Низкая стоимость
· Доступность для любой диагностической лаборатории
Недостатки
· Результат носит качественный характер
· Может быть использован не для всех препаратов (особенности диффузии некоторых препаратов в агаре)
· Большое влияние "человеческого фактора" на конечный результат
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.
Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий.
Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе.
Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106—107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры).
Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры.
Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.
Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.
К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.
Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.
Посев испытуемых культур производят на чашки с различными концентрациями антибиотика. После инкубации определяют минимальную концентрацию препарата, при которой подавляется рост штамма - минимальная ингибирующая концентрация (МИК). (мудл)
Достоинства метода
· Количественная характеристика резистентности
· Возможно отслеживать нарастание резистентности в популяции микроорганизмов
· Одномоментное определение резистентности большого количества штаммов к большому количеству препаратов (при использовании штампа-репликатора)
Недостатки метода
· Высокая трудоемкость, большой объем подготовительной работы.
· Не удобен для работы с единичными штаммами
Мудл:
Метод пограничных значений (break-point method)
Для реализации метода проверяют способность культуры к росту при двух (реже одной) концентрациях препарата. Указанные концентрации определяются на основании оценки резистентности циркулирующих штаммов.
Штамм, не способный к росту при меньшей концентрации, считается чувствительным (S), растущий при большей концентрации - устойчивым (R). Рост микроорганизма при меньшей концентрации препарата и подавляемый большей концентрацией позволяет отнести его к промежуточным (I). Использование только одной пограничной концентрации позволяет разделить микроорганизмы на устойчивые и резистентные, без выделения промежуточной группы.
Достоинства метода
· Экономичность
· Малая зависимость от квалификации персонала
· Применим в случаях, когда препарат плохо диффундирует в агаре (метод стандартных дисков неприменим)
Недостатки метода
· Определение носит качественный характер
Метод разведений в жидкой среде
Испытуемый штамм засевают в серию пробирок с бульоном, содержащим различные концентрации антибиотика. После инкубации учитывают результат. О наличии роста судят по помутнению среды (в некоторых случаях - по изменению окраски).
Определение проводят в обычных пробирках (макрометод) или в 96-ти луночных панелях (микрометод).
Достоинства метода
· Количественная оценка резистентности
· Простота учета
· Возможность автоматизации постановки и учета при использовании 96-луночных панелей
Недостатки
· Высокая трудоемкость (особенно при использовании макрометода)
Метод градиентных полосок (Е-тест)
На специальную полоску последовательно нанесены разведения антибиотика, что позволяет создать градиент его концентрации в агаре. Образующаяся зона задержки роста "пересекает" тест-полоску в той точке, которая соответствует минимальной ингибирующей концентрации препарата.
В настоящее время различные фирмы выпускают аналогичные тест-системы, отличающиеся технологией создания градиента. Наиболее инвестны E-test (bioMerieux), которые являются родоначальниками данного метода.