22. Методы культивирования вирусов. Вирусологический метод, основные этапы.

Вирусологический метод состоит из данных этапов:

1. Отбор и обработка материала для исследования. Исследуемый материал (фекалии, носоглоточные смывы, секционный материал, спинномозговая жидкость, кровь моча и т.д. – зависит от характера заболевания) центрифугируют, фильтруют, обрабатывают для подавления бактериальной и грибковой микрофлоры антибиотиками, добавляют к смеси гептан и фреон. Отбор проводится в ранние сроки заболевания при соблюдении правил, предотвращающих контаминацию материала посторонней микрофлорой и инфицирование медицинского персонала. Для предупреждения инактивации вирусов при транспортировке материала, он помещается в вирусную транспортировочную среду (ВТС), состоящую из сбалансированного солевого раствора, антибиотиков и сывороточного альбумина. Транспортируется материал в специальном контейнере с термоизоляцией и закрытыми пластиковыми пакетами, содержащими лед.

2. Заражение серии:

· Куриных эмбрионов (КЭ)

Для успешного культивирования вирусов в КЭ требуется определенный температурный режим (36-38С), влажность (50-70%) и достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определенного возраста, инкубированные от 6 до 13 дней. Перед заражением куриные эмбрионы овоскопируют: определяют их жизнеспособность, отмечают на скорлупе границу воздушного мешка и месторасположение эмбриона («темный глаз» эмбриона). Работа с куриными эмбрионами проводится в стерильном боксе стерильными инструментами (пинцеты, шприцы, ножницы, копье и др.). После выполнения фрагмента работы инструменты погружают в 70 % этиловый спирт и перед следующей манипуляцией прожигают. Перед заражением скорлупу куриного эмбриона протирают горящим спиртовым тампоном и спиртовым раствором йода. Объем исследуемого материала, вводимого в эмбрион, составляет 0,1-0,2 мл. Для выделения вирусов из одного материала используют не менее 4 куриных эмбрионов. Могут производит заражение на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в полость амниона, в желточный мешок.

· Культур клеток

Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Для этой цели используют солевые растворы и вирусологические питательные среды. Нередко добавляются антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового заражения. Вирусологические питательные среды – естественные питательные среды (солевые растворы Хенкса и Эрла + сыворотки + амниотическая жидкость + эмбриональные экстракты, напр., среда HeLa), ферментативные гидролизаты белковых веществ (напр., гидролизат лактальбумина + раствор Хенкса), синтетические питательные среды (напр., среда Паркера, среда Игла и т.д.).

· Лабораторных животных

Используются белые мыши, морские свинки, хомяки, кролики и др. Белые мыши наиболее чувствительны к большому числу видов вирусов. Способ заражения животных определяется тропизмом вируса к тканям. Заражение в мозг применяется при выделении нейротропных вирусов (вирусы бешенства, полиовирусы и др.). Интраназальное заражение проводят при выделении возбудителей респираторных инфекций. Широко используются внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и другие методы заражения. Заболевших животных усыпляют эфиром, вскрывают и производят забор материала из органов и тканей.

3. Оценивают феномены, указывающие на присутствие вируса

· Куриные эмбрионы – РГА, гибель, отставание в развитии, изменение оболочек

· Культуры клеток – ЦПД, образование бляшек, цветная проба Солка, гемадсорбция, интерференция, РГА, иммуннофлюоресценция

· Животные – заболевание, гибель, морфологические изменения в тканях

4. Титрование выделенного вируса

5. Идентификация выделенного вируса - используют диагностические иммунные сыворотки в РН, РТГА, РСК, цветной пробе Солка, РТНАдс, в реакции подавления бляшкообразования и др.