49. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Механизм. Способы постановки, применение
Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения.
В основе этой реакции лежит способность специфической антитоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.
Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.
Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тестобъектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.
Для проведения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследуемого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сывороткой, животные опытной группы останутся живыми. Контрольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.
Реакция применяется в двух направлениях:
1) для идентификации вирусов;
2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках.
Компоненты:
1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).
2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).
3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты.
50. Реакция преципитации. Механизм, компоненты. Способы постановки. Применение.
Реакция преципитации (РП) – это иммунная реакция взаимодействия АТ и АГ в присутствии электролитов, причем АГ находится в растворимом состоянии.
Компоненты: АГ (преципитоген), АТ (известная преципитирующая сыворотка), электролит (физ.раствор).
Механизм: происходит формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Преципитат образуется при смешивании АГ и АТ в эквивалентных количествах. Избыток одного из компонентов снижает количество осаждающихся иммунных комплексов.
Способы постановки (с применением)
Реакция кольцепреципитации – ставится в пробирках с малым диаметром (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Проводится в агаровом гелем. В слое геля равномерной толщины на определенном расстоянии вырезают лунки и заполняют их АГ и с сывороткой. После этого АГ и АТ диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют комплексы, которые преципитируют и становятся видимыми. Используют для определения неизвестных АГ и АТ и для проверки сходства между АГ. Если они идентичны, то линии преципитации сливаются, различны – линии преципитации пересекаются, частично идентичны – формируется шпора.
Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини. В расплавленный агаровый гель добавляют АТ и наносят гель равномерным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации АГ. Во время инкубации АГ диффундируют в гель и преципитируют, образуя кольца. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток АГ, происходит постепенное увеличение диаметра кольца. Метод используют для определения концентрации АГ и АТ в исследуемом растворе.
Иммуноэлектрофорез – предварительно электрофоретически разделяют смесь АГ, затем в канавку вносят преципитирующую антисыворотку. АТ и АГ диффундируют в гель навстречу друг другу, взаимодействуя образуют дугообразные линии.
5. Реакция флоккуляции по Рамону – для определения активности антитоксической сыворотки для анатоксина. Реакцию проводят в пробирках. При соблюдении эквивалентного соотношения анатоксина и антитоксина наблюдается помутнение.