43. Микологический метод диагностики микозов. Методы идентификации дрожжей и нитчатых грибов.
Микологический метод для идентификации чистой культуры (ЧК) и определения чувствительности к антифунгальным препаратам.
Выделение ЧК методами механического разобщения и культивирования на искусственных питательных средах.
Грибы растут медленнее бактерий (3 -5 дней). Образование колоний грибов на твердых питательных средах - результат апикального роста главной гифы и ее ответвлений.
Грибы обладают выраженной сахаролитической активностью, поэтому их выращивают на специальных средах, содержащих углеводы: l среда Сабуро, l сусло-агар, l морковный агар и другие, l а также среды с а/б. l l р. Н среды 4, 0 -6, 5.
Грибы растут в широком диапазоне температур (20 -45 °С).
Грибы, вызывающие заболевания человека, обычно культивируются при температуре +37 °С и +28 °С.
При росте многоклеточных грибов на питательных средах различают субстратный или погружной мицелий (врастающие колонии, большая часть в среде) и воздушный мицелий (большая часть его находится над питательной средой).
К методам идентификации дрожжей относят выявление морфологии клетки, определение способов формирования плодовых образований, способов сбраживания углеводов и утилизации азот- и углеродсодержащих соединений.
Фенотипическое описание дрожжей включает следующие этапы:
1) определение способа деления клеток. Выявление способов размножения (почкованием или делением клеток), определение морфологии клеток;
2) выявление наличия или отсутствия гифов и псевдогифов:
• выявление наличия или отсутствия половых образований;
• выявление способности сбраживать углеводы;
• определение способности к размножению на определенных углерод- и азотсодержащих, а также на других специфических культуральных средах.
Вегетативное размножение. Виды дрожжей родов Saccharomyces, Zygosaccharomyces делятся путем мультилатерального почкования, тогда как Hamemaspora — путем биполярного почкования.
Базидиомицетам также свойственны разные типы почкования. Большинство из них размножается путем полярного почкования — либо на узком основании, либо вблизи полюсов. Некоторым базидиомицетам свойственно типичное мультилатеральное почкование, тогда как другим свойственно и почкование, и деление. При исследовании молодой (24—48 ч) быстро развивающейся культуры почкующиеся клетки легко распознаются. Клетки же, размножающиеся делением, вскоре образуют концентрическую колонию вокруг исходной, так что способ размножения в данном случае не очевиден.
Дрожжи рода Candida (синоним Torulopsis) идентифицируют по критерию образования псевдогифов, причем признается, что, хотя некоторые виды, классифицируемые как Torulopsis, образуют псевдогифы, мицелий такого типа образуют не все штаммы дрожжей рода Candida. Образование истинных гифов также может служить признаком, используемым для различения штаммов.
Половые образования. Половые образования нередко формируются перед конъюгацией, которая происходит или между отдельными клетками, или между клеткой и ее почкой. Если в качестве конъюгата выступает почка, то место соединения зачастую слегка удлиняется, и стенка почки под микроскопом может выглядеть тоньше. Виды, для которых характерна конъюгация между клеткой и ее почкой, почти всегда гомоталломны.
Неконъюгированные аски образуются как гомо-, так и гетеро- талломными диплоидными штаммами. Неспособность штаммов формировать половые образования может свидетельствовать об отсутствии необходимых условий или о принадлежности данной культуры к родственному типу.
Методы анализа на молекулярном уровне являются быстрым и точным средством идентификации видов микроорганизмов. Их можно использовать в том числе и для обнаружения новых видов ДВПП. Потребность в количественной оценке генетического сходства штаммов и видов на молекулярном уровне была удовлетворена, в частности, благодаря методике реассоциации или гибридизации ядерной ДНК. ДНК из двух представляющих интерес видов разделяют, смешивают и выделяют однонитевую последовательность, после чего степень сходства определяют по уровню реассоциации. Для измерения применяют различные способы: как спектрофотометрические, так и с помощью радиоизотопов или других маркеров. Результат измерения комплементарности ДНК обычно выражают процентом связанности, но он может вводить в заблуждение, так как цепочки ДНК перед дуплексированием должны иметь подобие базовых сегментов не менее 75—80%, а результаты должны соотноситься со шкалой сходства. Существенное влияние на образование двойной спирали ДНК оказывают условия эксперимента, однако при проведении измерений в оптимальных условиях различные методы оценки сходства ДНК дают практически одинаковый результат. Процент сходства ДНК позволяет примерно оценить общее подобие геномов двух микроорганизмов, однако данным методом невозможно обнаружить различия в одном гене или безошибочно определить плоидность, хотя в некоторых случаях может быть выявлена анеуплоидия.