47. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.

Реакция агглютинации (РА) – это склеивание корпускулярных антигенов (агглютиногенов) – микробов, других клеток или частиц, носителей антигена, под воздействием специфических антител с образованием видимых газом аггломератов – хлопьев; реакция происходит только в присутствии электролита. В РА участвуют антитела-агглютинины класса IgM, а также IgG.

Различают РА прямую, при которой во взаимодействии со специфическими антителами непосредственно участвуют собственные антигены бактериальной или любой другой клетки, и непрямую, при которой бактериальные клетки являются носителями не собственных, а сорбированных на них чужих антигенов для выявления специфических к ним антител.

РА протекает в две фазы:

1. Поливалентные антигены и двухвалентные антитела образуют комплексы по типу решётки. Не сопровождается видимыми изменениями реагирующей системы.

2. В присутствии электролита снижается заряд комплексов АГ-АТ, уменьшается растворимость и образуются видимые аггломераты (хлопья), выпадающие в осадок. Образуется агглютинат.

Жгутиковые бактерии вызывают при взаимодействии со специфическими антителами H-агглютинацию, которая протекает быстро с образованием рыхлых крупных хлопьев. Бактерии без жгутиков образуют мелкозернистый осадок (О-агглютинация) и реакция протекает медленнее.

Способы постановки прямой РА:

1. РА на предметном стекле – для идентификации неизвестной выделенной чистой культуры бактерий. Методика:

· Ингредиенты: испытуемая культура бактерий на скошенном мясо-пептонном агаре, диагностическая агглютинирующая сыворотка, физ. раствор.

· На предметное стекло наносят каплю диагностической сыворотки (разведена физ.раствором 1:10-1:20) и каплю физ.раствора (контроль). Испытуемую культуру осторожно берут петлей с поверхности скошенного агара и вносят сначала в контрольную каплю физ.раствора, а затем в каплю с диагностической сыворотки. Склеивание бактерий происходит в течение первых минут наблюдения. При покачивании стекла, в капле с диагностической сывороткой образуются хлопья, а жидкость становится более прозрачной. Контрольная капля остается равномерно мутной.

2. Развернутая РА в пробирках – ставят для серологической диагностики (выявления антител в испытуемой сыворотке) и реже – для серологической идентификации возбудителя. В серодиагностике инфекционных заболеваний, при которых формируются антибактериальный иммунитет гуморального типа, связанный с выработкой антител. Методика:

· Ингредиенты: сыворотка больного, диагностикум – взвесь известных убитых микробов и физ.раствор

· В штативе устанавливают 7 пробирок, первые 5 – опытные, 6 и 7 – контрольные. В опытных пробирках готовят серийные 2-кратные разведения испытуемой сыворотки в объеме 1,0 мл. В каждую опытную пробирку вносят по 3 капли диагностикума. Контроли: 6 – контроль антигена (1 мл физ.раствора + 3 капли диагностикума), 7 – контроль сыворотки (содержит сыворотку в исходном разведении 1:25). Штатив с пробирками помещают на 2 часа в термостат при 37С, после чего проводят предварительный учет реакции. Окончательный учет проводят на следующий день, после выдерживания пробирок при комнатной температуре. Определяют титр сыворотки и делают заключение. Положит. ответ – образование хлопьев и просветление жидкости. Отриц. ответ – содержимое пробирок равномерно мутное. Контроли: в контроле антигена содержимое пробирки равномерно мутное, в контроле сыворотки – прозрачное, без осадка.

В реакциях непрямой агглютинации (РНА) используют корпускулярные носители – эритроциты, частицы латекса или бентонита, на поверхности которых адсорбируют молекулы антигена известной специфичности. Такие биопрепараты называют антигенными диагностикумами. При наличии в исследуемой сыворотке специфических антител к адсорбированным на носителях АГ, эти АТ вызывают склеивание корпускул диагностикума между собой. Образуются видимые аггломераты.

В зависимости от применяемых носителей (эритроциты, шарики латекса, стафилококков) различают следующие разновидности РНА:

1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

В качестве антигенного диагностикума применяют эритроциты, на которых адсорбируют растворимые антигены бактерий, бактериальные токсины или гаптены м/о. Эритроцитарные антигенные диагностикумы используют в РНГА для серодиагностики – выявления антител в сыворотке больного. Методика: исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56С в течение 30 минут для уничтожения комплемента и разливают в лунки (96-луночная полистероловая планшетка) по 0,1 мл. К каждому разведению добавляют 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. После 2 часов инкубации в термостате при 37С учитывают реакцию и определяют титр исследуемой сыворотки. Положительный результат – осадок эритроцитов в виде зонтика с зубчатыми краями, отрицательный результат – эритроциты оседают в центре в виде компактного диска с ровными краями (пуговка). Используется для диагностики многих инфекционных заболеваний (брюшной тифа, паратифов А и В, вирусных гепатитов…). РНГА высокочувствительная, следовательно, выявляется даже небольшое количество антител в начале заболевания.

2. Латекс – агглютинация – серологическая реакция, в которой используют полимерные микрошарики из латекса, на поверхности которых адсорбированы известные антигены. Механизм – аналогичен РНГА, реакцию проводят в капле жидкости на предметном стекле или на пластинках с лунками. Частицы латекса контрастно окрашены, и образующиеся через несколько минут хлопья хорошо видны. Экспресс-диагностика.

3. Коагглютинация – применяют в качестве экспресс-метода диагностики для выявления антигенов в исследуемых материалах. Диагностикум – взвесь клеток Staphylococcus aureus штамма Cowan 1 (содержит в клеточной стенке белок А, способный к адсорбции АТ), нагруженных АТ той или иной специфичности. РКоА ставят на предметном стекле или другой подложке. При соответствии определяемого антигена происходит агглютинация.