48. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, типы, компоненты, применение для индикации антигенов и иммунодиагностики

РИФ (также иммунофлюоресцентный анализ) относится к непрямым методам диагностики инфекционных заболеваний, т.к. она основана на выявлении антител (АТ) против возбудителя (серодиагностика) в исследуемом материале.

Чувствительность реакции иммунофлюоресценции 10⁷

Иммунологическая диагностика выполняется с помощью иммунологических реакций.

* Особенности иммунологических реакций:

1)специфическое взаимодействие АГ и АТ с образованием иммунных комплексов.

2)иммунный комплекс всегда содержит АГ и АТ

3)комплекс АГ-АТ визуально может проявляться или не проявляться

4)АГ-АТ взаимодействуют как целые молекулы без изменений в их химической структуре

5)связь АГ-АТ прочная, но обратимая

6)АГ и АТ соединяются в эквивалентных соотношениях

РИФ относится к 4-му типу реакций (реакции с мечеными АТ: АГ + АТ, могут применяться дополнительные компоненты , всегда присутствует АТ, соединенное с меткой)

Механизм:

- при прямом методе (пРИФ) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флуоресцентным красителем антител, образование комплекса АГ-АТ обнаруживается флуоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости

- при непрямом методе (нРИФ) на препарат наносят АТ против искомых АГ (то есть наносят «первые» антитела) (образуются иммунные комплексы определенного АГ со специфическими АТ), а затем наносят видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител (выявление ранее образовавшегося комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином);

* с флуоресцентным красителем конъюгированы только «вторые» антитела; флуоресцентное окрашивание наблюдается только после связывания со «вторым» антителом

Типы:

1) прямая РИФ (флюоресцирующие АТ+исследуемый АГ=светящийся комплекс)

2) непрямая РИФ (универсальная флюоресцирующая сыворотка+специфические АТ+исследуемый АГ=светящийся комплекс)

а) двухэтапный непрямой метод

б) трехэтапный непрямой метод (с комплементом)

* АТ метятся (конъюгируются) с флюоресцирующим красителем (чаще используют ФИТЦ (флуоресцеина изотиоцианат)– зеленое свечение в УФ свете и ТРИТЦ (тетраметилродаминизотиоцианат) – оранжево-красное свечение)

Участники (компоненты):

1. АГ- клетка микроорганизма или пораженная клетка макроорганизма.

2. Люминесцирующая сыворотка против искомого антигена.

3. Нелюминесцирующая кроличья сыворотка против искомого АГ.

4. Люминесцирующая сыворотка против иммуноглобулинов кролика.

5. Комплемент.

6. Люминесцирующая сыворотка против комплемента.

1) ПРЯМАЯ РИФ

1 – АГ (клетка микроорганизма или пораженная клетка макроорганизма)

2 – люминесцирующая сыворотка против искомого АГ

2) НЕПРЯМАЯ РИФ

А. двухэтапная (без комплемента)

1 – АГ (клетка микроорганизма или пораженная клетка макроорганизма)

2 – нелюминесцирующая кроличья сыворотка против искомого АГ

3 - люминесцирующая сыворотка против иммуноглобулинов кролика

Б. трехэтапная (с комплементом)

1 – АГ (клетка микроорганизма или пораженная клетка макроорганизма)

2- нелюминесцирующая кроличья сыворотка против искомого АГ

3 – комплемент

4 - люминесцирующая сыворотка против комплемента

* Критерии специфичности РИФ:

1)характерная форма и размеры микроорганизма

2)интенсивность свечения ( в так называемых «крестах» от одного + до четырех ++++) – субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя, абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце, при использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных

3)периферическое свечение (светящийся ободок)

* Техника: неизвестный образец закрепляется на пленке (может содержать искомые антигены), к нему добавляются меченные флюорецеином антитела, дается время для протекания реакции связывания, несвязавшиеся АТ смывают, далее наблюдают под флуоресцентным микроскопом

* Результаты: положительный – зеленая (при ФИТЦ) флюоресценция, отрицательный – отрицательная флюоресценция

* Преимущества РИФ: простота, высокая чувствительность, скорость получения результата (однако нужен люминесцентный микроскоп)

Применение РИФ: для ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса.

*Серодиагностика сифилиса (непрямая РИФ):