21. Культивирование бактерий in vitro. Требования к условиям культивирования. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам

Культивирование бактерий в системах in vitro осуществляется на питательных средах. Оно может быть периодическим и непрерывным.

Условия культивирования бактерий:

1. Наличие полноценной питательной среды. (см. ниже требования к питательным средам)

2. Температура культивирования. Температура влияет на скорость размножения. Для поддержания требуемой температуры используют термостаты.

3. Атмосфера культивирования.

4. Время культивирования зависит от времени генерации. Большинство бактерий культивируют до получения видимого роста в течение 18-48 ч. Для культивирования возбудителя коклюша требуется 5 суток, для культивирования M. tuberculosis – 3-4 недели.

5. Освещение. Для выращивания фототрофных бактерий необходим свет. Некоторые условно-патогенные микобактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент, что используется для их идентификации.

Для роста и размножения строгих аэробов необходим кислород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды; для роста в глубинных слоях необходимо диффузное распределение кислорода по всему объему питательной среды. Это достигается непрерывным перемешиванием или встряхиванием – аэрирование (на специальных аппаратах – встряхиватели).

Для культивирования факультативных анаэробов используют те же методы, однако в присутствии кислорода у них будет преобладать оксидативный метаболизм над ферментацией.

Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода; достигается за счет повышения парциального давления СО2 до 1-5% в атмосфере культивирования против 0,3% в атмосфере воздуха. Также используют специальные СО2-инкубаторы или посевы помещают в эксикаторы с горящей свечой (атмосфера 80% N2, 2-3% O2, 10-20% CO2).

Облигатные анаэробы требуют полного отсутствия кислорода.

• Добавлением к питательным средам редуцирующих кислород веществ: тиогликолевой и аскорбиновой кислот, цистеина, сульфидов;

• Кипячением жидких сред и плотное закупориванием сосудов резиновыми пробками;

• Использованием поглотителей кислорода, щелочного пирогаллола, и помещением в герметически закрытые емкости газ-паки (для аэротолерантных бактерий);

• Механическим удалением кислорода воздуха с последующим заполнением емкости инертным газом (используют анаэростаты и анаэробные боксы).

Для хемо- и фотоавтотрофных бактерий создается атмосфера, насыщенная СО2. Исторический метод – биологический по Фортнеру: чашку с агаром засевают культурами аэробов и анаэробов, между ними вырезают канавку и герметично закрывают, аэробы потребляют О2, снижая его концентрацию. Также используют регенерацию среды и заливку ее вазелиновым маслом: среды в пробирках плавят на водяной бане, дают остыть до 45-50 оС, делают посев, затем быстро охлаждают и заливают маслом.

Культивирования абсолютных внутриклеточных паразитов, бактерий, относящихся к родам Rickettsia, Ehrlichia, Coxiella, Chlamydia, осуществляют на культурах клеток, в организме животных и членистоногих, в куриных эмбрионах (кроме эрлихий). Куриные эмбрионы используют также для культивирования бактерий, обладающих высоким уровнем гетеротрофности, например родов Borrelia, Legionella.