4. Специфические симптомы наследственных болезней.

Редко встречающиеся специфические симптомы или их сочетания дают основание думать о наследственной природе заболевания (астеническое телосложение и деформация грудной клетки при с-ме Марфана).

5. Врожденный характер заболевания. 6. Резистентность к наиболее распространенным методам терапии. Одна из особенностей наследственных болезней - устойчивость к терапии, хотя и не абсолютная. Это вполне понятно, потому что «исправить» первичные звенья, даже если известен первичный продукт мутантного гена, далеко не всегда удается (мукополисахаридозы, миодистрофия Дюшенна, нейрофиброматоз).

89. Подходы к молекулярно-генетической диагностике. Молекулярно-генетические методы - это методы, которые позволяют выявить нарушения в строении гена на уровне днк.

Молекулярная идентификация мутаций в гене является самым объективным способом диагностики любого моногенного заболевания и может проводиться на любых стадиях его развития, доимплантационно, пренатально, доклинически.

В настоящее время различают прямую и косвенную ДНК-диагностику. При прямой диагностике объектом исследования является сам ген (его кодирующие последовательности). Для проведения прямой ДНК-диагностики необходимо точно знать структуру гена или его фрагмент, содержащий анализируемую мутацию. Точность реакции обеспечивается специфическими олигопраймерами.

Непрямая (косвенная) ДНК-диагностика применяется тогда, когда ген не секвенирован, не известны его структура, размеры, характер мутаций в нем, кодируемый белок, но известна его достаточно точная хромосомная локализация, то есть ген картирован, имеется информация о положении гена на цитогенетической карте.

Основными, наиболее часто используемыми методами ДНК-диагностики являются: полимеразная цепная реакция (ПЦР), блотгибридизационный анализ по Саузерну. Эти методы позволяют выяснить молекулярный характер мутации (делеция, миссенс и т. п.), проанализировать конкретный полиморфизм генетических маркеров (по длине рестрикционных фрагментов, длине тандемных повторов микро- и минисателлитов, однонуклеотидных замен и др.).

Технические приемы в молекулярной диагностике достаточно стандартны: 1. Получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК, представляющей собой весь геном организма, могут быть любые ядросодержащие клетки 2. Получение фрагмента ДНК, который соответствует области мутации. Для этого используются специфические олигопраймеры (специально созданные короткие последовательности нуклеотидов, которые комплементарны функционирующим отделам, искомого фрагмента ДНК).

3. Идентификация полученных фрагментов ДНК. Для этого используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Каждый фрагмент ДНК после окончания электрофореза занимает свое место и сравнивается со стандартными образцами ДНК с известным размером. Метод полимеразной цепной реакции. Метод ПЦР заключается в циклическом синтезе in vitro строго заданных, ограниченных участков ДНК, позволяет амплифицировать необходимый участок ДНК, являющийся предметом молекулярного анализа. Этапы ПЦР: 1. Денатурация двойной спирали ДНК-матрицы.

2. Гибридизация олигопраймеров с комплементарными последовательностями одноцепочечной ДНК.

3. Синтез комплементарной цепи на ДНК-матрице с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, а также добавления «строительного» материала – четырех видов дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (гуанидина, цитозина, аденина, тимина).

4. Идентификация «наработанных» фрагментов ДНК осуществляется с помощью различных методик электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Подвижность молекул фрагментов ДНК при электрофорезе является ключевым параметром и зависит от длины (молекулярного веса) и конформации изучаемого фрагмента ДНК. Чем больше молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле.

Блот-гибридизация по методу Саузерна.

Данный метод позволяет идентифицировать специфические последовательности нуклеотидов в общем наборе рестрикционных фрагментов геномной ДНК.

Основные этапы метода: 1. Проведение обработки полученной геномной ДНК одной из рестриктаз с закономерным для данного фермента набором фрагментов различной длины.

2. Разделение фрагментов при электрофорезе в геле в зависимости от их молекулярного веса.

3. После денатурации ДНК (путем ощелачивания) проведение процедуры блоттинга – переноса фрагментов ДНК с геля на нитроцеллюлозный фильтр.

4. Гибридизация денатурированных фрагментов ДНК с комплементарным радиоактивно-меченым зондом. После отмывки накладывается рентгеновская пленка (авторадиография). При проявлении на пленке видны полосы, комплементарные использованному зонду.