14.4. Рекомбинантные молекулы и проблемы генной

ИНЖЕНЕРИИ

Генетические векторы. Знание структуры молекулы ДНК, ее ге­нетической роли, механизмов репликации ДНК и биосинтеза бел­ка послужили основой развития новой науки — генетической ин­женерии. Ряд достижений молекулярной биологии и генетичес­кой инженерии воплощены в жизнь в области животноводства и ветеринарии: получены рекомбинантные вакцины против опас­ных инфекционных болезней животных, организовано производ­ство гормона роста, интерферона, аминокислот, лекарственных веществ, разработаны методы ДНК-зондирования, полимеразной цепной реакции и т.д.

В связи с этим рассмотрим основные этапы получения реком- бинантных молекул и использование их для решения проблем ве­теринарии. Для манипуляции с генами последние получают сле­дующими способами:

методом химико-ферментативного синтеза; синтезом ДНК-копий при помощи обратных транскриптаз; выделением из фрагментированной молекулы ДНК. Последний способ получения гена нашел широкое примене­ние, так как в настоящее время имеется большой набор фермен- тов-рестриктаз, так называемых генных ножниц, позволяющих разрезать молекулу ДНК в определенных участках и выделять не­обходимый ген.

Следующий элемент —это векторные молекулы, так называе­мые генетические векторы. Векторные молекулы ДНК способны перенести в клетку чужеродную ДНК и обеспечить там ее размно­жение (амплификацию) или включение в геном клетки.

В качестве вектора используют ДНК плазмид, фагов, вируса оспы, других вирусов и некоторых бактерий. Например, для полу­чения рекомбинантной молекулы ДНК вируса осповакцины ее разрезают при помощи рестриктаз и в несущественную часть ге­нома осповакцины вставляют ген, интересующий исследователя. Так получены рекомбинантные вакцины против чумы крупного рогатого скота, бешенства, классической чумы свиней и т. д.

Создана рекомбинантная вакцина на основе вируса оспы, со­держащего ген антигена вируса чумы крупного рогатого скота. При введении этой вакцины в организме животного образуются антитела, защищающие его от болезни. Вакцину можно приме­нять путем скарификации, что облегчает процедуру вакцинации. Она оказалась дешевле классической.

Полученная рекомбинантная вакцина против бешенства на ос­нове вируса осповакцины проверена на животных 30 видов и по­казала хорошие результаты. При иммунизации данной вакциной образуются нейтрализующие антитела, защищающие животных от этой инфекции.

Создана вакцина на основе генома вируса болезни Ауески (ДНК-вирус), в который включен ген антигена вируса классичес­кой чумы свиней (РНК-вирус). Это крупный успех в получении вакцины против двух инфекций одновременно. В качестве вектор­ной молекулы используют ДНК и других вирусов и бактериальных клеток. Хорошие результаты получены при использовании в каче­стве основы вакцинного штамма М. bovis (БЦЖ). В геном БЦЖ вставляют ген специфического антигена вирулентного штамма. Так созданы новые вакцины против туберкулеза, более эффектив­ные по сравнению с БЦЖ.

Кольцевидная ДНК плазмид использована для получения рекомбинантных молекул в целях производства гормона роста. При этом ген гормона роста вставляют в кольцевидную ДНК плазмид и далее эту рекомбинантную молекулу вводят в клетку кишечной палочки (Е. соН), где в процессе ее жизнедеятельности рекомби­нантная молекула экспрессируется, т. е. размножается, и соответ­ственно синтезируется гормон роста. Затем этот гормон выделяют из среды культивирования Е. coli и применяют для стимуляции роста откормочных бычков или для усиления молокоотдачи у дой­ных коров. Гормон вводят 1 раз в месяц. Он обеспечивает увеличе­ние продуктивности на 20 %.

Таким же способом производят интерферон — белок, обуслов­ливающий защиту организма от вирусных инфекций, ряд других лекарственных препаратов.

Генная терапия находится на стадии становления. В настоящее время предприняты попытки лечения генетических болезней. На­пример, лейкоциты, извлеченные из крови больного, культивиру­ют in vitro (вне организма) и при помощи ретровируса вносят в них дефицитный недостающий ген. Затем эти нормальные лейкоциты возвращают в организм больного. Так же поступают с клетками костного мозга: их культивируют in vitro, при помощи ретровируса вносят недостающий ген, а затем возвращают в организм.

Антисмысловые РНК и ДНК используют для создания транс­генных животных. Антисмысловые соединения — это короткие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК (иРНК), но с компле­ментарной по отношению к иРНК последовательностью. Это со­единение связывается с нуклеиновыми кислотами по тому же принципу, как при транскрипции — комплементарно, и таким об­разом блокирует синтез белка: трансляции не происходит. Если это антисмысловая ДНК, то она может задержать транскрипцию. Практически это осуществляют следующим образом: у больного берут костный мозг, клетки костного мозга культивируют in vitro, обрабатывая антисмысловой ДНК, при этом больные клетки по­гибают, и культура клеток получается здоровой. Параллельно с этим больного лечат облучением — убивают клетки костного моз­га. После этого пересаживают здоровые клетки (его же), получен­ные из культуральной клеточной линии.

В настоящее время активно изучают эффективность антисмыс- ловых олигонуклеотидов — цепочек ДНК и РНК — в качестве ин­гибиторов при различных заболеваниях. Они должны обладать специфичностью, т. е. быть комплементарными к гену данного возбудителя. В этом достигнуты определенные успехи: созданы антисмысловые РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, аденовируса, парвовируса. На основании их получены трансген­ные животные.

Трансгенез — перенос генов с целью изменить наследственные свойства животных, например путем переноса гена гормона роста. Животное, которое содержит в своем геноме чужеродный ген (трансген), называется трансгенным. Для переноса гена животных используют метод микроинъекции и ретровирусы, перенос ство­ловых клеток. Суть методов заключается в следующем.

Метод микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы — основной метод получения трансгенных животных. Метод разработан Дж. Гордоном (1980). В зиготу, фиксированную под микроско­пом, вводят рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую 100 и более копий гена. Далее зиготу трансплантируют самке-реципи­енту. На мышах получены трансгенные особи, содержащие ген интерферона, гормона роста, гемоглобина человека, кролика, аде­новируса, тимидинкиназы.

Инъекция трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион — второй способ получения трансгенных животных. Стволовые клетки способны делиться и дифференцироваться. Их умеют выделять и размножать в культуре. В выделенные стволо­вые клетки можно инъецировать генные конструкции, а затем включить эти клетки в бластоцисту реципиента.

Трансгенез осуществлен на лабораторных (мыши, крысы) и сельскохозяйственных (овцы, свиньи, кролики, коровы) живот­ных (К. Халитер и др., 1985; Д. Крамер и др., 1986).

Мышам в пронуклеус оплодотворенной клетки инъецировали микрошприцом гены интерферона, гормона роста, гемоглобина человека, кролика или аденовируса. Экспрессию гена гормона ро­ста проверяли по массе, методом ДНК-гибридизации, полимераз- ной цепной реакции и т.д. Наиболее доступным объектом для биотехнологии служат кролики; это связано с тем, что экспрессия чужеродного гена осуществляется в них наиболее часто — в 25 % случаев. Получены трансгенные овцы (Австралия, 1985) с геном гормона роста; их масса была в 1,5 раза выше таковой конт­рольных животных.

Трансгенез представляет интерес прежде всего для получения животных продуцентов биологически активных веществ и лечеб­ных препаратов. Например, трансгенных животных используют для продуцирования человеческого инсулина, фактора свертыва­ния крови, интерферона. Ведутся исследования по получению трансгенных животных, устойчивых к ряду заболеваний (гриппу, лейкозу и т. д.), многоплодных, с улучшенными хозяйственными признаками.

Ретровирусы в качестве векторов используют для получения биологически активных веществ (например, инсулина). Ретрови­русы — это РНК-содержащие вирусы, которые при помощи фер­мента обратной транскриптазы синтезируют в клетке ДНК. В клетке синтезируется двухцепочечная ДНК, содержащая генети­ческую информацию вирусной РНК. Такая ДНК интегрируется в хромосомную ДНК клетки, образуя провирус.

Клонирование животных. Клон — это генетически однородные потомки одной исходной особи, образующиеся в результате бес­полого размножения.

Для создания генетических копий сельскохозяйственных живот­ных методом клеточной инженерии разработан следующий способ клонирования: пересадка ядер соматических клеток в яйцеклетку с предварительно удаленным ядром. Для этого от донора берут ство­ловые (непрошедшие дифференцировку) клетки. Ядро стволовых клеток in vitro вводят в энуклеированные яйцеклетки реципиента. Полученные таким способом зиготы крупного рогатого скота мож­но культивировать in vitro до 8-, 16- и даже 32-кпеточной стадии. Такие эмбрионы, достигшие завершающих стадий предимпланта- ционного развития, можно не только трансплантировать коровам- реципиентам или замораживать для длительного хранения, но и использовать для последующего клонирования. Таким образом, в условиях in vitro можно получать неограниченное число эмбрионов. Метод клонирования животных очень привлекателен для получе­ния неограниченно большого числа копий от высокопродуктивных особей, а потому разрабатывают его очень интенсивно.

14.5. ДНК- И РНК-ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Достижения молекулярной биологии по изучению роли нукле­иновых кислот в процессах жизнедеятельности привели к разра­ботке совершенно новых методов диагностики болезней живот­ных и человека на основе уникальных свойств ДНК и РНК. Это методы молекулярной гибридизации и полимеразной цепной ре­акции.

Метод молекулярной гибридизации. Метод молекулярной гибри­дизации (ДНК-гибридизация, ДНК-зонды) широко применяют для диагностики инфекционных болезней, в генетике, кримина­листике и т. д. Метод основан на уникальном свойстве генетичес­кого материала организма — молекулы ДНК, состоящей из моно­нуклеотидов, — образовывать двойную спираль с комплементарно соединенными азотистыми основаниями. Известно, что молекула ДНК представляет собой полимер, состоящий из дезоксирибонук- леотидов четырех видов (дАМФ, дГМФ, дТМФ, дЦМФ), соеди­ненных между собой У- и 5'-фосфодиэфирными связями дезокси- рибоз. Молекула ДНК образует двойную спираль, при которой азотистые основания первой цепи строго комплементарно соеди­няются водородными связями с азотистыми основаниями второй цепи, при этом аденин соединяется с тимином, гуанин с цитози- ном.

Принцип метода. Структуру двухцепочечной ДНК (или РНК), скрепленную водородными связями, можно разрушить нагрева­нием, поскольку спаренные, не связанные между собой ковалент- но, две полинуклеотидные цепи ДНК после разрыва всех водород­ных связей полностью разделяются.

Процесс разделения цепей называют денатурацией, или плавле­нием ДНК. Денатурация происходит в узком интервале температур и сопровождается гиперхромным эффектом, т. е. при этом возрас­тает поглощение ультрафиолетовых лучей. Температуру, при ко­торой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плав­ления (Г_пл), которая в зависимости от состава ДНК составляет примерно 85...95 °С. Процесс денатурации ДНК обратимый, т.е. при понижении температуры (отжиг) водородные связи восста­навливаются и вновь образуется двухспиральная молекула ДНК. Это явление называют ренатурацией (рис. 14.5).

Ренатурация связана со специфичностью спаривания азотис­тых оснований между комплементарными цепями. Реакция про­исходит в две стадии: вначале короткие комплементарные после­довательности двух цепей случайно соединяются друг с другом и образуют двухспиральный участок, затем образуется длинная двухцепочечная структура с восстановлением первоначальных свойств, утраченных при денатурации.

В ренатурации участвуют две комплементарные последователь­ности. Если при этом взяты цепочки молекулы ДНК из различных источников, то говорят о гибридизации, например при отжиге ДНК и РНК.

В основе гибридизации лежит тот же принцип спаривания комплементарных оснований, который обеспечивает репликацию ДНК или ренатурацию молекул. Способность к гибридизации

двух препаратов нуклеиновых кислот является строгим тестом на комплементарность их последовательностей.

Способы гибридизации. Гибридизацию можно осуществлять в растворе или на фильтре (капроновом или нитроцеллюлозном). При гибридизации молекул в растворе препараты (одноцепочеч- ные молекулы) смешивают и определяют образование двухцепо- чечных молекул при отжиге по изменению гиперхромного эффек­та или же по количеству метки в двухцепочечной ДНК (для этого один из препаратов ДНК предварительно метят радиоактивным изотопом). Удобен для работы метод гибридизации с использова­нием фильтров. При этом один из препаратов ДНК иммобилизу­ют на нитроцеллюлозных фильтрах, на которых молекула ДНК адсорбируется. Фильтры с адсорбированной одноцепочечной ДНК обрабатывают таким образом, чтобы предотвратить дальней­шую адсорбцию одноцепочечных молекул.

На рисунке 14.6 показана схема гибридизации на фильтре. Фильтр с адсорбированной ДНК погружают в раствор, содержа­щий второй препарат денатурированной ДНК (ДНК-зонд). Свя­зывание ДНК-зонда происходит только в том случае, если он име­ет комплементарную последовательность с первоначально адсор­бированной на фильтре молекулой ДНК.

Эффективность гибридизации определяют по количеству мет­ки, оставшейся на фильтре. Метод очень чувствительный и его

применяют для изучения структуры гена. При этом необходимо иметь меченные радиоактивным изотопом РНК или ДНК-зонды, идентификация которых с исследуемой молекулой регистрируется с помощью радиоавтографии. В качестве зонда используют клони­рованную кДНК-копию, т. е. меченную радиоактивным изотопом молекулу ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.

Один из способов гибридизации — метод блоттинга по Саузерну.

Для идентификации гена молекулу ДНК генома расщепляют при помощи ферментов рестриктаз на куски размером примерно по 15...20 тыс. пар нуклеотидов. Расщепленный таким образом ге­ном подвергают электрофоретическому фракционированию в агарозном геле. После этого фракции ДНК денатурируют нагревани­ем и переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где их иммобилизуют. Процесс переноса ДНК называется мето­дом блоттинга по Саузерну (блоттинг, от англ. blotting— пятно, клякса). Сущность блоттинга заключается в том, что агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, смоченную в концент­рированном солевом растворе; затем на гель накладывают нитро- целлюлозный фильтр и сверху помещают сухую фильтровальную бумагу. Солевой раствор впитывается в сухую бумагу; чтобы это произошло, он должен пройти сквозь агарозный гель и затем че­рез нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится вместе с ра­створом, но задерживается нитроцеллюлозой. Иммобилизован­ную таким образом ДНК можно гибридизовать на месте с радиоак­тивным зондом. Со специфическим зондом будут гибридизиро- ваться только комплементарные ему фрагменты. Так как зонд радиоактивный, то гибридизацию можно обнаружить при помощи авторадиографии. Каждая комплементарная последовательность проявляется в виде радиоактивной полосы, местоположение кото­рой определяется размером фрагмента ДНК. Схема метода блоттинга по Саузерну представлена на рисунке 14.7.

Метод блоттинга высокочувствительный и точный, его широко применяют в криминалистике, медицине, ветеринарии. В настоя­щее время метод молекулярной гибридизации разработан для ди­агностики инфекционных болезней сельскохозяйственных живот­ных, например для обнаружения возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза, туберкулеза, ящура, чумы свиней, чумы птиц, энтеро- вирусов и т. д. Этот метод перспективен также для изучения пле­менных качеств животных. Он имеет преимущества перед приня­тым в настоящее время в селекции методом изучения маркеров белкового полиморфизма.

Полагают, что метод ДНК-гибридизации может успешно ис­пользоваться в селекции быков, так как геном быков можно разделить на гены, которые в дальнейшем выявляются блоттин- гом. При этом, чтобы оценить геном по признаку молочной продуктивности, необходимо выделить около 75 фрагментов ДНК.

В последние годы разрабатывается новый метод анализа ДНК, так называемая геномная дактилоскопия. Метод включает следу­ющие этапы: выделение ДНК; фрагментацию ее при помощи фер­ментов — рестриктаз; фракционирование при помощи электрофо­реза в геле. Фрагменты ДНК, содержащие гипервариабельные участки, выявляют при помощи специального зонда — «.пробы Джеффриса», с которой они связываются путем гибридизации. Участки гибридизации выявляют путем авторадиографии.

Исследования показали, что в этом методе в качестве радиоак­тивного зонда может быть использована ДНК, выделенная из бак­териофага М13. ДНК этого бактериофага содержит еще один тип гипервариабельной последовательности, который найден также и в геноме человека. Принцип строения этой гипервариабельной пос­ледовательности в общих чертах сходен со строением мини-сател- литной ДНК Джеффриса. Использование этой новой пробы для геномной дактилоскопии показало ее высокую эффективность и пригодность для решения многих задач. Дело в том, что эти гипер­вариабельные последовательности обнаружены у человека, живот­ных, растений и бактерий, а потому ДНК-зонд бактериофага М13 может быть использован в широких масштабах, например, для идентификации личности, для установления родства любых живых существ. Метод дает возможность решать вопросы генетики и се­лекции животных, вести отбор по полезным признакам; используя этот метод, можно вести генную паспортизацию отдельных высоко­продуктивных животных, анализировать родословную и получен­ные сведения использовать для направленной селекции.

Существует еще одна разновидность гибридизационного ана­лиза ДНК —это метод точечной гибридизации (дот-гибридиза­ция) (рис. 14.8), который выполняют, нанося исследуемые образ-

цы ДНК в денатурированном состоя­нии на капроновые мембранные фильтры в виде точек в квадрате.

Одноцепочечные молекулы ДНК (денатурированные) адсорби­руются на мембране и фиксируются. После этого на фильтр нано­сится ДНК-зонд, меченный радиоактивным фосфором, т. е. одно- цепочечную молекулу М. bovis, меченную ³²Р. Поскольку в данном случае азотистые основания молекул ДНК М. bovis и меченного ³²Р ДНК-зонда комплементарны, то происходит связывание азо­тистых оснований нитей ДНК и ДНК-зонда с образованием двой­ной спирали. После этого несвязанные молекулы ДНК-зонда от­мывают и образующиеся гибридные молекулы выявляют путем радиоавтографии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Из молекулярных методов диагностики наибольшее распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР). Предложенный в 1983 г. американским биохимиком К. Маллисом метод ПЦР в корне изменил подход к молекулярной диагностике наследственных и инфекционных забо­леваний, судебно-медицинской экспертизе вещественных доказа­тельств, установлению родства и анализу родословных, системати­ке микроорганизмов, растений, животных и т.д. За изобретение ПЦР К. Маллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии.

Полимеразная цепная реакция — наиболее точный на сегод­няшний день метод исследований по генной диагностике. Прин­цип метода заключается в том, что по данным банка генов различ­ных организмов выявляют специфический для данного организма (бактериальной клетки, вируса) ген — участок молекулы ДНК, не­сущий информацию для синтеза одного белка. К участкам данно­го гена синтезируются затравки — праймеры — длиной 15...25 нуклеотидов.

ПЦР представляет собой надежный, высокочувствительный метод, хорошо защищенный от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. В модельной системе при диагностике вирусных инфекций удается регистрировать порядка десяти гено­мов в пробе (Р. Р. Виноградская и др., 1991). Полагают, что предел чувствительности ПЦР-диагностикума при условии использова­ния 100 мкл необогащенного клинического образца в качестве пробы составляет 10^-10 возбудителей в 1 мл. Такой чувствительно­сти достигают только культуральные методы диагностики. ПЦР имеет преимущество перед культуральными методами, поскольку им можно обнаружить возбудители болезней, которые не удается выращивать в лабораторных условиях.

Суть полимеразной цепной реакции (рис. 14.9) заключается в том, что молекулу ДНК подвергают температурному плавлению, т. е. нагревают до 90...94 °С, что ведет к денатурации — разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спи­рали, а затем охлаждают (отжиг) до 52 °С в присутствии праймера, фермента ДНК-полимеразы и всех четырех дезокситрифосфатов.

Последующее повышение температуры до 70...72 "С приводит к синтезу новой молекулы ДНК, комплементарной матричной. Эту процедуру плавления, отжига и синтеза ДНК повторяют много­кратно, в результате чего количество выбранного фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии.

Специфичность метода уникальна, так как она обусловлена последовательностью нуклеотидов затравки (праймера) и в зави­симости от цели исследования можно выявить вид, группу видов или род микроба. Так, использовав в качестве праймера олигонук- леотид гена gro El микобактерий, можно установить наличие в об­разце представителей любого из 30 видов рода Mycobacteria; прай­мера IS 986 (или IS6110) — представителей любого из четырех ви­дов — возбудителей туберкулеза человека, относящихся к Mucobacterium tuberculosis complex, праймер к IS 900 выявит один- единственный вид — Mycobacterium paratuberculosis (В. А. Ланцев и др., 1993).

Продолжительность реакции определяется числом циклов, не­обходимых для синтеза ДНК-амплификата в количестве, доста­точном для дальнейшего исследования или индикации. Индика­ция может быть осуществлена путем электрофореза или при по­мощи меченого ДНК-зонда.

Для постановки ПЦР необходимы следующие приборы и реак­тивы:

ДНК-амплификатор (термоциклер) — прибор, обеспечиваю­щий циклическую смену температур по заданной программе (вы­пускаемые в настоящее время термоциклеры рассчитаны на одно­временное проведение до 96 реакций);

стандартный набор лабораторного оборудования для выделе­ния генетического материала из исследуемых образцов, постанов­ки электрофореза; центрифуга типа Eppendorf; магнитная мешал­ка Vortex, автоматические пипетки; источник питания; электрофоретические камеры; трансиллюминатор; одноразовые наконеч­ники и пробирки для ПЦР;

термостабильная ДНК-полимераза, выдерживающая много­кратный нагрев до 96 "С. Это фермент, выделяемый из бактерий, обитающих в горячих источниках (гейзерах). В настоящее время известны два штамма термофильных бактерий, из которых выделе­ны эти ферменты (Termus aquaticus и Termus thermophilics), соответ­ственно обозначаемые Taq-полимераза и Tth-полимераза;

праймер — олигонуклеотид из 15...20 нуклеотидов, является затравкой для синтеза новой молекулы ДНК. Данный олигонукле­отид должен быть специфичным для исследуемого организма (возбудителя болезни). Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе, пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК;

дезоксинуклеозидтрифосфаты — dNTP, предшественники син­теза ДНК.

В настоящее время выпускают специальные наборы для ПЦР, предназначенные для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, бруцеллеза, ящура и других инфекционных болезней жи­вотных. Обычно один набор содержит компоненты для анализа 100 образцов. На рисунке 14.10 показаны результаты проведения

полимеразной цепной реакции по идентификации классической чумы свиней (КЧС).

Контрольные вопросы и задания

1. Каковы особенности репликации молекулы ДНК и главные участники это­го процесса? 2. Перечислите этапы транскрипции (синтеза РНК). 3. Каков хи­мизм распада пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований? 4. Дайте опре­деление понятиям «ген», «геном», «хромосома».