8. Ферменты 8.1. Общая характеристика ферментов

История открытия ферментов. Ферменты, или энзимы, пред­ставляют собой высокоспециализированный класс веществ белко­вой природы, участвующих в осуществлении происходящих в жи­вых организмах многих тысяч взаимосвязанных химических реак­ций, включая синтез, распад и взаимопревращение разнообразных химических соединений.

Жизнь и многообразие ее проявлений — это сложная совокуп­ность химических реакций, катализируемых ферментами. Фер­менты отличаются от неорганических катализаторов рядом харак­терных свойств: ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют каталитическую активность в условиях температуры тела, нор­мального давления и (в основном) при нейтральных значения? рН. Каждый фермент катализирует, как правило, только одну хи­мическую реакцию, т. е. ферменты высокоспецифичны. Каждыг фермент имеет специфическую первичную структуру, активносп фермента контролируется как на генетическом уровне, так и по­средством низкомолекулярных соединений: субстратов и продук­тов реакций, катализируемых этими же ферментами.

Молекула фермента имеет уникальную структуру и, соответ­ственно, уникальную функцию.

Энзимология — учение о ферментах — решает вопросы молеку­лярной структуры ферментов и природы химических взаимодей­ствий, лежащих в основе ферментативного катализа. Изучение ферментов имеет огромное значение как в теоретическом, так и в прикладном аспекте. Ферменты применяют в различных отраслям промышленности, сельского хозяйства, медицины. Например, за­готовка кормов — сушка травы, приготовление сенажа, силоса применение ферментных препаратов в качестве добавок к кор­мам — основана на процессах, связанных с активностью фермен­тов. Фармакологическое действие многих лекарственных препара­тов обусловлено определенным механизмом взаимодействия их с ферментами. Процессы пищеварения, всасывания, разнообразные проявления жизни — рост, развитие — связаны с действием опре­деленных ферментов.

Явления брожения и переваривания известны давно, но учение о ферментах зародилось в 1814 г., когда Петербургский ученыг К. С. Кирхгоф показал, что не только проросшее зерно ячменя, не и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превраще­нием его в мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячме­ня и обладающее способностью превращать крахмал в мальтозу получило название амилазы. В последующем были открыты другие ферменты, в частности пепсин, трипсин, вызывающие гидроли: белков в пищеварительном тракте. Наибольшее внимание иссле­дователей привлекали процессы окисления в организме. Напри­мер, было известно, что горение сахара на воздухе происходит медленно, если же добавить немного солей лития, то горение са­хара идет очень интенсивно в соответствии со следующим уравне­нием^-

В живых организмах «горение», точнее окисление углеводов, также протекает быстро и до тех же конечных продуктов, т. е. СО₂ и Н₂О с выделением энергии. Однако эта реакция происходит при относительно низкой температуре, без пламени, в присутствии воды. Это «горение» — окисление сахара в организме — осущест­вляется под действием биологических катализаторов — фермен­тов. Сейчас известно, что в окислении глюкозы до СО₂ и Н₂О уча­ствуют до 15 различных ферментов.

Биологические катализаторы — ферменты — осуществляют те же реакции, которые возможны по термодинамическим условиям, но они их лишь ускоряют, так же, как и неорганические катализа­торы. Например, пероксид водорода Н₂О₂ может медленно рас­щепляться на молекулярный кислород О₂ и Н₂О и в отсутствие катализатора, но в присутствии платины (порошок) эта реакция идет с высокой скоростью:

Эту же реакцию можно провести с высокой скоростью в при­сутствии фермента каталазы (например, содержащегося в эритро­цитах), при этом образуются те же конечные продукты.

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты катализируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям, катализирующимся неорганическими веществами.

Ферменты долгое время считали «организованными» (JI. Пастер) и «неорганизованными», так как полагали, что ферменты, сбраживающие сахар, связаны с целой клеткой, а кипячение инактивирует фермент. Лишь опыты М. М. Манасеина (1871 г., растер­тые с измельченным песком дрожжи), Э. Бухнера (1897 г., дрож­жевой сок, полученный под давлением 500 атм.), А. Н.Лебедева (зимаза из дрожжей, получена настаиванием высушенных дрож­жей в теплой воде) показали, что ферментативная активность не связана с целой клеткой, что фермент может быть выделен из кле­ток. Это послужило началом детального изучения процесса анаэ­робного окислительно-восстановительного расщепления углево­дов. В настоящее время установлено, что любая химическая реак­ция, протекающая в организме, может быть осуществлена вне организма, если удается выделить соответствующий фермент, ка­тализирующий данную реакцию. Правда, следует учесть, что ряд ферментов прочно связан с морфологическими структурами клет­ки — биомембранами. В целостном организме имеется тесная связь между функцией фермента и его структурой, связанной с клеточными образованиями.

Биосинтез и клеточная локализация ферментов. Биосинтез моле­кулы фермента осуществляется в клетке по схеме синтеза белка и наиболее интенсивно это происходит в период роста и развития. В отдельных органах ферменты синтезируются в больших количе­ствах. Например, слюнные, желудочные, кишечные, поджелудоч­ная железы синтезируют ферменты, обеспечивающие гидролити­ческое расщепление кормовых масс. Для ферментов характерна определенная клеточная локализация. В клеточном ядре находят­ся ферменты обмена нуклеиновых кислот — ДНК-полимераза, гираза, РНК-полимераза и т. д.; в митохондриях — ферменты цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи, окисления жирных кислот; в цитозоле — ферменты гликолиза, синтеза жирных кис­лот, активирования аминокислот; в рибосомах — ферменты бел­кового синтеза; в лизосомах — ферменты, гидролизующие белки, нуклеиновые кислоты, липиды и полисахариды — катепсины, ДНКазы, РНКазы, фосфатазы и т.д. При этом ферменты в клетке находятся не в разрозненном состоянии, а функционируют в виде агрегатов, сложных, строго упорядоченных структур. Формирова­ние этих структур осуществляется с участием молекулярных шаперонов, т. е. временных сопровождающих участников, которые не входят в состав конечных продуктов. Шапероны состоят из 7-членного кольца (бублика), имеют форму колеса и «катятся» по ниточке актина (при сокращении мышечной ткани) или вдоль микротрубочек, транспортируя белковые молекулы к месту назна­чения. Так, полиферментный пируватдегидрогеназный комплекс состоит из трех ферментов. В состав этого комплекса молекуляр­ной массой 4,6 · 10⁶ в клетке Escherichia coli входят 24 молекулы гшруватдегидрогеназы, 24 молекулы дегидролипоилтрансферазы, 12 субъединиц дегидролипоилдегидрогеназы и 3 дополнительных белка. Этот комплекс диаметром 30 нм осуществляет непрерыв­ный ферментативный процесс окислительного декарбоксилирова- ния и его регуляцию. Гликолиз (если он начинается с гликогена) обеспечивается участием 14 ферментов, находящихся в виде слож­ного комплекса на мембранах, его называют метаболоном. Мета­болой — это надмолекулярный комплекс ферментов, катализиру­ющих последовательные стадии метаболического пути в структур­ных элементах клетки.

Химическая природа ферментов. Ферменты — это белки. Под­тверждением этого служит тот факт, что ферменты брожения при кипячении инактивируются (JI. Пастер), т. е. происходит необра­тимая денатурация белка-фермента, который при этом теряет свою способность катализировать химическую реакцию. Точно так же при кипячении белки теряют другие биологические свой­ства — антигенные, гормональные, каталитические. При гидроли­зе ферменты распадаются на аминокислоты.

Многие ферменты выделены в виде индивидуального белка в кристаллической форме. К настоящему времени свыше 200 фер­ментов выделены в чистом виде и изучена их первичная структура. Первый кристаллический фермент уреаза был получен в 1926 г. Дж. Б. Самнером. В 1930 г. Д. X. Нортрап выделил в виде кристал­лов пепсин, в 1931 г.— трипсин.

Будучи белками, они обладают амфотерными свойствами — могут существовать в растворе в виде анионов, катионов и амфионов; обладают электрофоретической подвижностью, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности; неспособны к ди­ализу через полупроницаемые мембраны; легко осаждаются мето­дом высаливания, ацетоном, этанолом; обладают высокой молеку­лярной массой (табл. 8.1).

Ферменты обладают высокой специфичностью действия. В по­следние годы показано, что кроме белков ферментативной актив­ностью обладают и молекулы РНК, их называют рибозимами. Ка­талитическая активность присуща также некоторым антителам, их называют абзимами. Так, антитела, образующиеся при аутоиммун­ных заболеваниях, способны гидролизовать белки, РНК и ДНК. Иммуноглобулины G молока и их фрагменты могут гидролизовать моно-, ди- и трифосфаты.

Ферменты — это вещества белковой природы, и, чтобы сохра­нить их стабильность, необходимо учитывать следующее:

оптимальная температура ферментативной реакции: для тепло­кровных животных 37...40 °С, при выделении и очистке ферментов 0 "С. Нужно помнить, что некоторые ферменты чувствительны к пониженной температуре (АТФаза из митохондрий);

рН в пределах 6,0...8,0 оптимален для большинства ферментов, хотя некоторые из них наиболее активны при рН 2,0 (пепсин) или 7,0... 10,0 (трипсин);

осаждение ацетоном и спиртом проводят при низкой темпера­туре, что позволяет сохранять нативность ферментов.

Для получения нативных белковых препаратов и их длительно­го хранения используют лиофильную сушку — высушивание в ва­кууме из замороженного состояния: например, криоконсервирование крови, антигенов, антител-диагностикумов, вирусных, бак­териальных препаратов; получение сухого молока и т. д.

Для стабилизации ферментов применяют хелатообразующее вещество ЭДТА — этилендиаминтетраацетат, который связывает ионы тяжелых металлов (Сu, Pb, Hg и т. д.), тем самым способ­ствуя сохранению нативных свойств фермента.

8.2. СТРОЕНИЕ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Строение ферментов. Ферменты могут быть представлены про­стыми и сложными белками. Однокомпонентные ферменты — это простые белки; к ним относятся гидролитические ферменты: пеп­син, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др.

Двухкомпонентные ферменты —это сложные белки, кроме белковой части апофермента они содержат небелковый компо­нент — кофермент; такие ферменты называют холоферментами.

Кофермент может быть соединен с белковой частью ковалентной связью, но между ними могут быть и слабые связи — водород­ные, электростатические взаимодействия и др.

В случаях слабой связи между коферментом и белковой частью при выделении может происходить диссоциация — небелковая часть отделяется и изолированный белковый компонент лишается ферментативной активности. Такими коферментами являются ви­тамины: В, (тиамин), В₂ (рибофлавин), В₆ (пиридоксин), РР (ни­котинамид) и др. Ферменты, содержащие их, при выделении, очи­стке, как правило, теряют активность и вновь приобретают ее лишь при добавлении кофактора. Многие двухвалентные металлы (Mg⁺ , Мп⁺², Са⁺²) выполняют роль кофакторов, хотя их не отно­сят к коферментам; в ряде случаев ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой и выполняют функции простетической группы. Например, фермент, катализирующий окисление витами­на С (аскорбиновой кислоты) в дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит восемь атомов меди на одну молекулу. Все они прочно связаны с белковой молекулой: не обмениваются ионообменными смолами и не отделяются путем диализа. Доказано, что ионы меди принимают участие в переносе электронов.

Коферментами являются: витамин РР (никотинамид), В₂ (ри­бофлавин), пантотеновая, фолиевая кислоты, биотин (вита­мин Н), В1 (тиамин), В₆ (пиридоксин), В₁₂ (цианкобаламин), ви­тамин Q (убихинон); они связаны с нуклеотидами (НАД НАДФ ФМН, ФАД, КоА, ТДФ, ПФ и т.д.).

Кофакторами могут быть соединения, не относящиеся к ви­таминам: HS-глутатион, АТФ, липоевая кислота, производные нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоадено- зинфосфосульфат), порфиринсодержащие вещества и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК, которые в составе фер­мента аминоацил-тРНК-синтетазы принимают участие в син­тезе белка.

Следует подчеркнуть, что ни кофермент, ни апофермент в от­дельности каталитической активностью не обладают. Лишь в виде комплекса они проявляют свою активность фермента.

Активный центр фермента. Молекула фермента, особенно у сложных ферментов, очень крупная и при взаимодействии с суб­стратом в контакт входит лишь ее ограниченная часть — активный центр фермента, в котором различают каталитический участок, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с суб­стратом, и «контактную» (якорную) площадку, которая обеспечи­вает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом (рис. 8.1).

Выявление химической природы и топографии групп активно­го центра представляет собой важную проблему — необходимо оп­ределить первичную структуру и взаиморасположение аминокис­лот в активном центре. Для решения этого вопроса применяют различные приемы (ингибиторы, частичный гидролиз и т. д.).

Сейчас известно, что первичная структура активного центра определяется генетически и реализуется при синтезе белка в рибо­сомах. Любое воздействие, связанное с денатурацией, приводит к нарушению активного центра и, соответственно, к потере фер­ментативной активности. Если удается восстановить третичную структуру фермента, то восстанавливается функция активного центра, что было доказано для рибонуклеазы поджелудочной железы.

Ферменты имеют один, два и более активных центра. Фермент уреаза имеет три активных центра, а холинэстераза — 20 активных центров. Активный центр состоит из 8... 10 аминокислотных остат­ков, чаще всего в него входят серии, гистидин, тирозин, трипто­фан, глутаминовая кислота.

В молекуле фермента различают также аллостерический центр (от гр. alios — другой, clereos — пространственный). Ферменты, ак­тивность которых контролируется состоянием как активного, так и аллостерического центра, получили название аллостерических ферментов, их называют также регуляторными ферментами.

Ферменты имеют множественные молекулярные формы, кото­рые называют изоферментами и гетероферментами.

Изоферментами (изоэнзимами) называют белки, обладающие ферментативной активностью и катализирующие одну и ту же ре­акцию. Они встречаются у животных одного и того же вида, но различаются физико-химическими свойствами, сродством к суб­страту, коферменту и ингибитору. Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) осуществляет превращение молочной и пировиноградной кислот, имеет молекулярную массу 140 000, ее молекула состоит из четырех субъединиц. Различают ЛДГ-1, содержащуюся в мы­шечной ткани сердца, и ЛДГ-2 — в мышечной ткани скелета; они различаются по электрофоретической подвижности.

Гетероферментами называют группы ферментов, различаю­щихся по размерам молекул. Ферменты, выполняющие одинако­вые функции, могут встречаться в различных формах не только у разных животных, в различных органах одного и того же животно­го, но и в разных частях клетки.

Изоферменты участвуют в регуляции отдельных звеньев обме­на веществ. Например, изофермент лактатдегидрогеназы из сер­дечной мышцы (ЛДГ-1) резко тормозится пируватом, а из скелет­ной мышцы (ЛДГ-2) менее чувствителен к нему.

Регуляция активности ферментов. Аллостерическая регуляция сопровождается изменением сродства фермента к субстрату без изменения максимальной скорости реакции. Это очень распрост­раненная и чувствительная регуляция.

Широко представлены такие коферменты, как АМФ, АДФ, АТФ, НАД, НАДН, НАДФ, НАДФН, лимонная кислота, ацетил - КоА и ряд других, которые одновременно являются субстратами, продуктами и регуляторами ферментативных реакций.

Регуляция активности ферментов происходит также ковалент- ной модификацией. Открытие этого пути — важнейшее достиже­ние биохимии. Активирование и ингибирование активности фер­ментов фосфорилированием их киназами, участие циклической АТФ в процессах действия гормонов, наличие специфических ре­цепторов гормонов в мембранах клеток — все это является новым этапом в изучении регуляции обмена веществ.

Общая схема регуляции при этом заключается в следующем: циклический АМФ (цАМФ) присоединяется к регуляторной субъединице, что ведет к освобождению его активной каталити­ческой субъединицы, т. е. концентрация цАМФ, его образование под влиянием циклазы и расщепление под влиянием фосфодиэстеразы лежат в основе регуляции целого ряда путей обмена ве­ществ. Фосфорилирование также представляет собой распростра­ненный механизм регулирования активности ферментов обмена веществ.

Гормональная регуляция активности ферментов заключается в том, что имеется связь между влиянием гормонов на процессы транскрипции и модификацией негистоновых белков ядра. Гор­моны могут выступать как эффекторы (сенсорные участки) ДНК и т. д.

Нервная регуляция активности ферментов и ее влияние на об­мен веществ изучается давно. Показано, что после перерезки не­рвов меняются свойства целого ряда ферментов мышечной ткани.

Механизм действия ферментов. Проблемами структуры и функ­ции ферментов, изучением вопроса механизма их действия заняты ведущие лаборатории мира. Повышение скорости реакции под действием ферментов объясняют тем, что при ферментативном катализе фермент соединяется (в принципе, обратимо) со своим субстратом, образуя нестойкий промежуточный фермент-суб­стратный комплекс, который в конце реакции распадается с ос­вобождением фермента и продуктов реакции (Арни, Михаэлис, Ментен, 1910—1915). JI. Михаэлис не только постулировал обра­зование промежуточного фермент-субстратного ES-комплекса, но и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость ре­акции.

В процессе реакции различают следующие стадии: присоединение молекулы субстрата к ферменту; преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов; отделение конечных продуктов реакции от фермента. Приведем пример:

Схема образования промежуточного фермент-субстратного комплекса представлена на рисунке 8.2. Если фермент в активном центре содержит кофермент, то образуется тройной комплекс.

Существование такого комплекса получило доказательство лишь в последние годы. Фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период. В образовании фермент- субстратного комплекса участвуют водородные связи, электроста­тические и гидрофобные взаимодействия, а также в ряде случаев ковалентные, координационные связи. Информация о природе связей может быть получена методами электронного парамагнит­ного резонанса (ЭПР), ядерного магнитного резонанса (ЯМР), ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии. Для каталити­ческой активности существенное значение имеет пространствен­ная структура ферментного белка, в которой жесткие участки а-спиралей чередуются с гибкими, эластичными линейными от­резками, обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. В каталитическом процессе существенное значение имеют точное соответствие между ферментом и субстра­том, а также термодинамические и каталитические преимущества подобного соответствия. Это означает, что между ферментом и субстратом должна быть не только пространственная или геомет­рическая комплементарность, но и электростатическая — спари­вание противоположных зарядов (групп) субстрата и активного центра фермента.

Таким образом, в механизме ферментативного катализа веду­щую роль играют промежуточные фермент-субстратные комплек­сы, образование которых определяется тонкой структурой актив­ного и эффекторного центров и уникальной структурой всей мо­лекулы фермента, обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность действия биокатализаторов.

Кинетика ферментативных реакций зависит от природы реаги­рующих веществ (фермента, субстрата) и условий их взаимодей­ствия — концентрации, рН среды, температуры, присутствия ак­тиваторов или ингибиторов.