3.3. Методы выделения, фракционирования и очистки белков

3.3.1. Методы выделения белков

Для подробного исследования физико-химических и биологи­ческих свойств белков, химического состава и строения необходи­мо получить индивидуальные белки в высокоочищенном, гомо­генном виде. Для этого биологический материал измельчают (го­могенизируют), белки извлекают (экстрагируют), разделяют (фракционируют).

Гомогенизация. Для измельчения биологического материала су­ществуют различные измельчители-гомогенизаторы (ножевые, пестиковые), а также шаровые мельницы. Для получения вирусных белков биологический материал подвергают попеременно за­мораживанию и оттаиванию. Применяют разрушение ультразву­ком, пресс-методы (пропуская замороженный материал через мелкие отверстия под давлением) и т. д.

Экстракция белков. Для экстракции белков используют различ­ные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, неионные детергенты — вещества,' нарушающие гидрофобные взаимодействия между белками и ли­ни дами и между белковыми молекулами.

Для этих целей эффективны глицерин, растворы сахарозы, бу­ферные смеси — фосфатные, цитратные, боратные со значениями рН от слабощелочных до кислых, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Широко применяют трисбуфер [например, 0,2 М раствор трис(оксиметил)аминометана с 0,1 М раствором НС1 в разных соотношениях]. Белки сыворотки крови выделяют методом осаждения этиловым спиртом (получе­ние гамма-глобулина), ацетоном, бутиловым спиртом и т д.

Для выделения альбуминов и глобулинов применяют осажде­ние сульфатом аммония (NH₄)₂S0₄. Для разрыва белково-липид- ных связей используют различные детергенты (для отделения от мембран)— тритон Х-100, додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и т.д.

3.3.2. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

После экстрагирования белков, т. е. перевода их в растворенное i остояние, приступают к разделению, фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют следую­щие методы:

• высаливания;

• осаждения органическими растворителями;

• тепловой денатурации;

• хроматографии;

• гель-фильтрации;

• ультрацентрифугирования;

• кристаллизации;

• электрофореза;

• распределения в двухфазных системах.

Рассмотрим наиболее распространенные методы фракциони­рования и очистки белков.

Как известно, растворение белков в воде связано с гидратацией отдельных молекул, что приводит к образованию вокруг белковой молекулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориенти­рованных определенным образом в пространстве молекул воды. Вода гидратной оболочки отличается от чистого растворителя. Ра­створы белков крайне неустойчивы и под действием разнообраз­ных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому добавление к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейт­ральных солей щелочных металлов), а также воздействие физичес­ких факторов (нагревание, облучение) приводит к дегидратации молекул и их выпадению в осадок.

Высаливание белков. При высаливании белка солями щелочных и щелочно-земельных металлов белок обычно не теряет способно­сти вновь растворяться в воде после удаления солей (диализом, гельфильтрацией). Глобулины выпадают в осадок при 50%-ном, а альбумины — при 100%-ном насыщении раствора сульфатом ам­мония. При выпадении белковой молекулы в осадок большое зна­чение имеет не только концентрация солей, но температура и ионная сила раствора.

Хроматография. Метод хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. В. Цветом, основан на способности пигментов (или других веществ) специфически связываться с адсорбентом, заключенном в колонке; используются также процессы сорбции и десорбции. Применяют различные методы хроматографии — ад­сорбционную, распределительную, ионообменную.

При адсорбционной хроматографии адсорбен­том служат активированный уголь, оксид алюминия или кремния. Широко применяют для разделения белков и другие вещества.

При распределительной хроматографии твер­дая фаза является только носителем для жидкой фазы. Разработа­на хроматография на бумаге; на колонках, где в качестве стацио­нарной фазы применяют крахмал или селикагель.

При ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы, представляющие собой полимерные орга­нические соединения, содержащие функциональные группы, спо­собные вовлекаться в ионный обмен.

Различают анионообменники (органические основания и ами­ны), катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- и кар­боксильные группы. Широко применяют диэтиламиноэтилцел- люлозу (ДЭАЭ-целлюлоза), триэтиламиноэтил (ТЭАЭ) и амино- этил-целлюлозы (АЭ-целлюлозы).

Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков со специфическими веществами, закрепленными на носи- гелс. В качестве носителя применяют активированную бромцианом сефарозу (CNBr-сефароза), к которой присоединяют различ­ные вещества — субстрат, кофермент, антиген, гормон и т.д. Метод позволяет одноэтапно получить высокоочищенный препарат белка.

Гель-фильтрация. Гель-фильтрацию, или метод молекулярных сит, широко применяют для очистки белков от примесей.

С использованием сефадекса (декстран, полисахарид микроб­ного происхождения, обработанный для разделения белков) мож­но разделить белки с разной молекулярной массой, так как зерна сефадекса разных номеров имеют различного размера поры, в которые способны проникать белки с определенной молекулярной массой.

Электрофорез. Метод основан на различии в скорости движе­ния белков в электрическом поле, которая определяется величи­ной заряда белка при определенных рН и ионной силе раствора. Первоначально метод разработан А. Тизелиусом, в последнее вре­мя широко применяется метод зонального электрофореза белков на различных носителях — на бумаге (целлюлозе), крахмале, в полиакриламидном геле. Метод диск-электрофореза в полиакриламидном дном геле позволяет получить до 50 фракций белков, т. е. имеет очень высокую разрешающую способность.

Изоэлектрическое фокусирование белков. Метод позволяет на лмфолинах выделить индивидуальные белки в препаративных ко­личествах.

Ультрацентрифугирование. Ультрацентрифугирование в гради­енте плотности сахарозы или хлорида цезия получило широкое применение для очистки, а также определения молекулярной массы белков по константе седиментации (единица Сведберга — S).

Очистка белка от низкомолекулярных примесей. Наилучшие результаты достигаются методом диализа, гель-фильтрации, крис­таллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полу­проницаемые мембраны (целлофан, коллоидиновая пленка), диаметр пор которых варьируется в широких пределах. Белки, как правило, через такую мембрану не диффундируют, а низкомоле- купярные вещества легко проходят через нее в окружающую среду. Наилучшие результаты дают методы гель-фильтрации и ультрафильтрации, так как дают возможность как освободиться от низкомолекулярных компонентов, так и сконцентрировать белки.

Методы определения гомогенности белков. Наилучшие результаты дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, иммунохимические ме­тоды.