4.3. Дезоксирибонуклеиновая кислота

Нуклеиновые кислоты — высокомолекулярные соединения из нуклеотидов (рис. 4.6). Чем сложнее клетка, тем больше генетической информации, следовательно, больше ДНК.

Например, вирусы содержат одну молекулу ДНК или РНК сравнительно не­большого размера. Фаги (вирусы бактерий) также содержат одну молекулу ДНК из 40...200 тыс. пар нуклеотидов. Бактериальные клетки имеют более сложную структуру и больше ДНК. Так, клет­ка кишечной палочки (Е. coli) имеет генетический материал из 4 • 10⁶ пар нуклеотидов (молекулярная масса 26-10¹²) длиной 1,4 мм, что в 700 раз больше самой клетки. Клетка человека содер­жит 3·10⁹ нуклеотидов в 46 хромосомах. Общая длина молекулы ДНК составляет около 2 м. Одна хромосома содержит одну моле­кулу ДНК. Основная масса ДНК находится в клеточном ядре в хромосомах. Однако небольшая часть ДНК (около 0,1 %) обнару­жена в митохондриях. Количество ДНК на одну клетку в пико­граммах (пг) составляет: у человека — 6,8; у курицы — 2,3; дрож­жевых клеток —0,05; клеток Е. coli — 0,01. Нуклеотидный состав ДНК изучен Чаргаффом (1949). Он установил, что нуклеотидный состав ДНК из различных тканей животных одного вида одина­ков, не зависит от возраста, условий питания и внешней среды. Определены правила Чаргаффа для ДНК;

сумма пуриновых нуклеотидов равна сумме пиримидиновых нуклеотидов: А + Г = Т + Ц;

молярное содержание аденина равно молярному содержанию тимина (А = Т или А/Т = 1);

молярное содержание гуанина равно молярному содержанию цитозина (Г = Ц или Г/Ц =1);

количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и ти­мина (А + Ц = Г + Т или А + Ц/Г + Т = 1);

в ДНК из различных источников неодинаково соотношение нуклеотидов: у одних преобладает содержание аденина над гуани­ном, тимина над цитозином (А + Т < Г + Ц), у других гуанин и ци­тозин преобладают над аденином и тимином (Г + Ц > А + Т), т. е. имеется видовая специфичность ДНК по нуклеотидному составу.

Благодаря применению различных методов электрофореза, а также ферментов рестриктаз («генных ножниц»), меченых соеди­нений, методов секвенирования и других современных методов молекулярной биологии изучена последовательность нуклеоти­дов — первичная структура нуклеиновых кислот.

Первичная структура ДНК. Она образуется путем выделения мо­лекул воды из группы —ОН у З'-углерода пентозы одного нуклео- тида и группы —ОН — у фосфорной кислоты другого нуклеотида.

Вторичная структура ДНК. Это спирализация полидезоксирибонуклеотидной цепи, вернее двух цепей. Выяснение вторичной структуры ДНК — одно из крупнейших открытий в биологии, так как при этом был раскрыт молекулярный механизм передачи ге­нетической информации в ряду поколений. В 1953 г. Дж. Уотсон и Ф. Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных цепей. Полинуклеотидная цепь расположена в форме спирали с одним оборотом (шагом) 10 пар нуклеотидов, что составляет 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм, при том между амино- и кетогруппами азотистых оснований образу­ются водородные связи. Две нуклеотидные цепи образуют правую спираль, при этом углеводно-фосфатные группы располагаются снаружи, а азотистые основания — внутри, где аденин первой цепи соединяется двумя водородными связями с тимином второй пени, а гуанин — с цитозином тремя водородными связями. Связь A=Т и Г≡Ц называется комплементарной. Связь между указанны­ми азотистыми основаниями является строго специфичной. Так, если в одной цепи последовательность нуклеотидов составляет АТГЦ, то во второй цепи напротив них будут комплементарные им ТАЦГ. Таким образом, последовательность нуклеотидов в од­ной цепи автоматически определяет последовательность нуклео- гидов в другой, комплементарной ей цепи.

Исследования показали, что кроме указанной выше В-формы ДНК (репликативной формы) в зависимости от влажности и ряда других условий могут быть: А-форма молекулы при транскрипции (один виток насчитывает 11 пар нуклеотидов, цепь короче 25%); С-формы надмолекулярных структур (один виток имеет 9.3 пар оснований); Z-формы (левая спираль, на один виток при­ходится 12 пар нуклеотидов). Известны и другие формы («бок о бок», кольцевидная форма, одноцепочечная и т.д.).

Из физико-химических свойств кроме большой длины молекулы следует отметить денатурацию молекулы ДНК, которая проис­ходит при повышении температуры свыше 80 "С. При этом раз­рываются водородные связи между азотистыми соединениями, двухцепочечная молекула «расщепляется» на составляющие цепи (отжиг). Полная денатурация ДНК —это расхождение компле­ментарных цепей. При охлаждении раствора денатурированной цепи ДНК до температуры ниже 80 °С нативная структура восста­навливается (происходит ренатурация). Образование двойной спирали ДНК по принципу комплементарности широко приме­няют для диагностики инфекционных болезней животных мето­лом молекулярной гибридизации, ДНК-зондирования, полимеразной цепной реакции, а также для генетических исследований. Принцип комплементарности обеспечивается при синтезе новой молекулы ДНК, когда происходит удвоение молекулы — реплика­ция ДНК, что очень важно для передачи генетических особеннос­ти организма (рис. 4.7). Модель репликации ДНК предложена Дж. Уотсоном и Ф. Криком. Комплементарные цепи родительс­кой ДНК разделяются, и на каждой из них синтезируется компле­ментарная им нить.

Третичная структура ДНК и организация хроматина в клетках животных. Молекула ДНК очень длинная, поэтому в клетке плот­но «упакована» путем сверхспирализации с участием основных белков. ДНК клетки находится в составе хромосом ядер и лишь небольшая часть ее находится в митохондриях. Суммарный мате­риал хромосом — хроматин — содержит ДНК, гистоны, негистоновые белки и небольшое количество РНК.

До 50 % хроматина составляют гистоны, которые богаты основ­ными аминокислотами — аргинином и лизином, на долю которых приходится до 25 % аминокислотных остатков белка. Радикалы этих аминокислот при рН 7,0 протонированы (NH₃⁺), несут поло­жительный заряд. Гистоны соединяются с отрицательно заряжен­ной (за счет остатка фосфорной кислоты) двухцепочечной ДНК с образованием комплекса ДНК-гистон. Различают пять видов гистонов: HI—богатый лизином; Н2А, Н2В — богатые лизином и аргинином; НЗ и Н4 — богатые аргинином. Все гистоны подверга­ются модификациям — метилированию, ацетилированию, фосфо- рилированию и поли-АДФ-рибозилированию. При этом в их мо­лекулах изменяется распределение электронной плотности, что меняет характер их связи с ДНК. Полагают, что таким образом осуществляется механизм регуляции активности генов. Упаковка молекулы ДНК начинается с образования нуклеосом. Нуклеосома — это комплекс двухцепочечной молекулы ДНК с гистонами, где около 200 пар нуклеотидов делает два оборота вокруг восьми

молекул гистонов (по две молекулы Н2А, Н2В, НЗ и Н4). Между пуклеосомами расположена соединительная (линкерная) ДНК из 20….120 пар нуклеотидов, связанная с гистоном H1 (см. рис. 4.7, б). Пуклеосомы обеспечивают плотную упаковку молекулы ДНК. Они упорядоченно расположены в пространстве и образуют путем скручивания в суперспираль толстые фибриллы — соленоиды. Та- кая упаковка ДНК в хроматине обеспечивает уменьшение линей­ных размеров ДНК в 10 000 раз.

Цитоплазматическая ДНК. Эта ДНК содержится в митохондриях в составляет 0,1 % общего количества ДНК клетки. Это двухцепочечные кольцевые молекулы сравнительно небольшого размера (около 10^-6 мм). В цитоплазме бактериальных клеток кроме хромо- I омпой ДНК имеются добавочные кольцевидные молекулы ДНК, ич называют плазмидами. Плазмиды способны автономно размно­жаться, стабильно наследуются. Мелкие плазмиды содержат генетическую информацию для двух-трех белков, а крупные могут ко­дировать до 200 белков. Количество их в клетке может быть различ­ное: мелких — несколько десятков, крупных — одна-две. Плазмиды могут обусловливать вирулентность бактерии, устойчивость к отдельным антибиотикам: тетрациклину, стрептомицину и т.д. Плазмиды широко используют в генетической инженерии.

Молекула ДНК является материальным носителем генетичес­кой информации. Геном —это совокупность генов данного организма. Ген (цистрон) — участок ДНК, несущий информацию для синтеза одного белка (полипептида). Различают: структурные гены, которые кодируют полипептиды и РНК; регуляторные гены, выполняющие регуляторные функции. Число генов в одной хромосоме зависит от сложности организма: у мелких вирусов их несколько десятков, у вируса оспы около 200, у бактериальных I меток несколько тысяч, геном человека содержит около 35 000.

Благодаря использованию высокопроизводительных секвенаторов (приборов для определения последовательности нуклеотидов в пенях) к 2003 г. геном человека, состоящий из 3,2 млрд нуклеотидов, Пыл полностью расшифрован. Сейчас известны геномы 400 видов олк терий, дрожжей, нематод, рыб, растений. На завершающем эта­пе находится анализ генома мыши, крысы, кролика, свиньи, шим­панзе. Расшифровка их важна для изучения процессов эволюции и создания универсальной системы классификации живых организ­мов.