III класс. Гидролазы. Они разрывают внутримолекулярные свя­зи путем присоединения

Глюкозилтрансферазы — переносчики глюкозидных остатков:

К ним относятся гликогенсинтазы, глюкозилтрансферазы, фосфорибозилтрансферазы и т.д.

Алкилтрансферазы: переносчики спиртовых останков. К ним относятся холинтрансфераза, фосфатилдиэтиламинтрансфераза и др.:

К ним относятся следующие подклассы: эстеразы, гликозидазы, пептидазы, амидазы, полифосфатазы.

Эстеразы гидролизируют эфирные связи по схеме:

Например, фосфодиэстеразы гидролизуют фосфорные эфиры:

диацилглицерин-3-фосфорная кислота + НОН→диацилглицерин + Н₃Р0₄

К этому подклассу относятся: фосфатазы (кислая, щелочная), глюкозо-6-глюкозо-1-фосфатаза, РНКаза и др.

Карбоксиэстеразы гидролизуют сложные эфирные связи:

К этим ферментам относятся: липазы, лецитиназы, простые эс­теразы и т. д.

Сульфоэстеразы гидролизуют сернокислые эфиры по следую­щей схеме:

Гликозидазы гидролизуют гликозидные связи, к ним от­носятся: а- и β-амилазы, мальтаза, лактаза, сахараза.

Пептидазы гидролизуют пептидные связи по следующей схеме:

В результате гидролиза образуется две молекулы аланина. Различают эндопептидазы — пепсин, трипсин, хемотрипсин; экзопептидазы — аминопептидаза, карбоксипептидаза, дипептидазы, трипептидазы.

А м и д а з ы гидролизуют амидные связи пуриновых и пиримидиновых оснований, амидов аминокислот и аргинина:

Полифосфатазы этой группы гидролизируют фосфороангидритные связи:

АТФ + О →(АТФаза)→АДФ +

К этой группе относятся Na⁺-, К⁺-, Mg+2-АТФазы и др.

IV класс. Лиазы. Это ферменты, расщепляющие связи без учас­тия воды, разрывая при этом связи С—С, С—N, С—О. К ним от­носятся ферменты альдолаза, декарбоксилаза и др. Например, альдолаза разрывает связи С—С гексозы (1,6-дифосфофруктозы) с образованием двух триоз: фосфодиоксиацетона и фосфоглицери- нового альдегида:

V класс. Изомеразы (мутазы). Катализируют изомеризацию, изомерные превращения молекул, например молекулы глюкозы во фруктозу. Мутазы изменяют местоположение различных групп или атомов в молекуле. К ним относятся: фосфоглицеромутаза, фосфоглюкомутаза, фосфофруктомутаза и т. д. Например, фосфо-

диоксиацетон под действием изомеразы превращается в фосфоглицериновый альдегид:

Сюда относятся ферменты: ДНК-полимеразы; РНК-полимеразы; ферменты, катализирующие синтез белков, и т. д.

8.6. Применение ферментов

Ферменты получили широкое применение в животноводстве и ветеринарии. Их используют как свободные ферментные препара­ты или в виде иммобилизованных ферментов. Иммобилизацию ферментов проводят путем прикрепления их к структурам, нера­створимым в воде. Иммобилизованные ферменты легко отделяют­ся от реакционной среды, что позволяет вести процесс непрерывно. Носителями фермента могут быть селикагель, окись алюминия, активированный уголь, полисахариды, иониты, органические по­лимеры. Связывание фермента может осуществляться методом ковалентного связывания, электростатического связывания, сополи- меризации или же фермент может быть включен в полимер, инкап­сулирован, включен в липосомы. При связывании фермента важно сохранить его активный центр. В качестве мостика часто использу­ют глутаровый альдегид, бромид циана (CNBr). Молекулу фермен­та можно заключить в капсулы, ограниченные мембраной, фикси­ровать в полимерах, при этом наиболее удобна полимеризация в полиэтиленгликоле (ПЭГ), в полиакриламиде (ПААГ). В настоя­щее время удалось получить иммобилизованный фермент, способ­ный функционировать в течение 1 мес при температуре 60...70°С. Иммобилизованные ферменты можно использовать в аналитичес­ких целях, для получения биологических соединений, в лечебных целях (в медицине, ветеринарии), в кормлении животных, для ди­агностики инфекционных болезней (иммуноферментный анализ).

Применение иммобилизованных ферментов в аналитических це­лях. Существует два типа устройств с иммобилизованными фер­

ментами, применяемые в аналитических целях, — ферментные электроды и автоматические анализаторы.

Ферментный электрод — это датчик, способный генерировать электрический потенциал в результате реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом. Разработаны ферментные элект­роды для определения глюкозы, мочевины, аминокислот, спирта, пенициллина и ряда других веществ.

Например, глюкозочувствительный ферментный электрод со­держит иммобилизованную глюкозооксидазу, которая катализи­рует удаление протонов водорода из раствора со скоростью, зави­сящей от концентрации в среде глюкозы:

Т.е. окисление альдегидов происходит путём дегидрирования. Альдегиды существуют в водных растворах в форме гидратов:

Затем атом водорода переходит через пленку к платиновому электроду, меняет потенциал (рН), что и регистрирует прибор. По этому принципу разработан прибор для определения концентра­ции сахара в крови. Прибор напоминает авторучку; на нем имеет­ся пластинка для нанесения пробы (капли) крови и экран, на ко­тором высвечивается содержание глюкозы (в процентах) в про­бе. Результат получают через 30 с после нанесения пробы. В приборе иммобилизованный фермент реагирует с глюкозой. Ве­личина потенциала на шкале соответствует содержанию глюкозы (в миллиграмм-процентах).

На этом же принципе основано использование индикаторной бумаги, например, для определения глюкозы в моче больных са­харным диабетом. На индикаторную бумагу наносят каплю мочи, и если в ней содержится глюкоза, то под действием иммобилизо­ванного фермента глюкоза окисляется в глюконовую кислоту, что обусловливает изменение рН. Метод очень удобен для контроля состояния больных и назначения лечения.

В настоящее время разрабатывают подобные приборы для оп­ределения содержания холестерина в крови (показатель атеро­склероза) и других соединений.

Применение ферментов в лечебных целях. Для этого выпускают свободные или иммобилизованные ферментные препараты. При­меняют ферментные препараты преимущественно при гнойно-не­кротических процессах [трипсин, химотрипсин, химопсин, террилитин, РНКаза, ДНКаза, коллагеназа, аспераза, лизоамидаза (бактериальный фермент), профезим, карипазин (фермент из па­пайи), лекозим]; для улучшения процессов пищеварения [пепсин, сок желудочный, пепсидал, аболин, панкреатин, ораза, сализим, нигедаза (липолитический фермент)].

Для применения в ветеринарии выпускают иммобилизованные ферменты: фермсорб — сополимер метакриловой кислоты и три- этиленгликоль-диметакрилата с сорбированными на нем литическими ферментами. Происходит лизис клеточной оболочки и сорб­ция полимерной матрицей патогенных микроорганизмов. При диарее телят различной этиологии препарат дают внутрь с кипяче­ной водой 3 раза в день. Полиферм — сополимер метакриловой кислоты и триэтиленгликоль-диметакриловой кислоты с сорбиро­ванными в нем протеолитическими ферментами.

При лечении желудочно-кишечных заболеваний молодняка ус­пешно применяют протеолитические ферменты: пепсин, амилосубтилин, протосубтилин, иммобилизованные ферменты (профе­зим, иммозим). Лизосубтилин — универсальный протеолитический фермент производят в нашей стране в больших объемах.

Лизоцим, гликозидаза, коллитин — бактериолитические фер­менты, применяемые при желудочно-кишечных заболеваниях мо­лодняка сельскохозяйственных животных.

Фермент гиалуронидаза (лидаза) разрушает гиалуроновую кис­лоту, тем самым улучшая проницаемость тканей.

Полимер из глюкуроновой кислоты и ацетилгюкозамина пред­ставляет собой межклеточное вещество; содержится в структуре кожи, связок; регулирует поступление различных соединений, пи­тательных веществ.

Ферменты ДНКазу, РНКазу применяют для разложения слизи­стой массы в дыхательных путях — для ингаляции, в виде салфе­ток, пропитанных ферментами (гиалуронидазой, ДНКазой, РНКазой).

Применение ферментных препаратов в кормлении животных.

В настоящее время в кормлении животных и кормопроизводстве широкое распространение находят ферментные препараты, при помощи которых можно существенно улучшить переваримость кормов и усвоение организмом питательных веществ, а также ус­корить процессы пищеварения. Для этой цели промышленность выпускает различные ферментные препараты бактерий и грибов. Их получают путем глубинного (Г) или поверхностного (П) куль­тивирования, затем высушивают путем распылительной сушки. Благодаря этому активность фермента повышается по сравнению с исходной в 3, 10, 15 раз, что обозначают как Зх, 10х, 15х.

Широкое применение получили ферментные препараты ами- лосубтилин и протосубтилин, полученные выращиванием специ­альных штаммов Bacillus subtilis. Амилосубтилин ГЗх содержит а-амилазу, протеазы, (3-глюказу; стандартизируется по а-амилаз- ной активности. Протосубтилин ГЗх содержит те же ферменты, но стандартизируется по нейтральной протеазе.

Различные штаммы Aspergillus awamori служат продуцентами глюкаваморина, пектаварина, ксилаваморина. Глюкаваморин ПЮх содержит а-амилазу, декстриназу, мальтазу, глюкоамилазу, кислую протеазу, гемицеллюлазу; стандартизируется по декстриназе. Пектаваморин ГЗх содержит полигалактуроназу, полиметил- галактуроназу, пектинэстеразу, кислую протеазу; стандартизиру­ется по общей пектолитической активности. Ксилаваморин ГЗх содержит гемицеллюлазу и пектиназу; стандартизируется по гемицеллюлазной активности.

Из культуры Aspergillus oryzae получают препарат амилоризин ПЮх, который содержит а-амилазу, декстриназу, мальтазу, проте­азу; стандартизируется по а-амилазе.

Кроме того, производят ферментные препараты пектофоетидин ГЗх, пектоклостридин, пектонигрин и т. д.

Добавление указанных ферментных препаратов в корм живот­ных значительно улучшает переваримость грубых кормов, усвоение питательных веществ, способствует увеличению продуктивности.

Использование иммобилизованных ферментов для производства биологических соединений. Иммобилизованные ферменты широко применяют для производства различных продуктов и лекарствен­ных препаратов. Впервые иммобилизованный фермент в про­мышленном масштабе был использован для разделения рацеми­ческих смесей D- и L-аминокислот (Япония, 1969). В настоящее время получают L-аспарагиновую кислоту, L-тирозин, L-триптофан и другие аминокислоты путем присоединения к аминокис­лотам остатка уксусной кислоты (ацил) и воздействия аминоаци- лазой, которая гидролизует только ацил L-аминокислот.

В промышленном масштабе получают инвертный сахар (смесь глюкозы и фруктозы, возникающая в результате гидролиза сахаро­зы) при помощи иммобилизованной β-фруктофуранозидазы (сахаразы). Этот фермент очень устойчив и за 10 лет непрерывной рабо­ты одного из реакторов его активность снизилась всего на 10 %.

При помощи иммобилизованного фермента глюкозоизомеразы в больших объемах из кукурузного крахмала получают смесь глю­козы и фруктозы. Этот фермент превращает глюкозу во фруктозу. Такие установки функционируют в США (с 1972 г.), ФРГ, Дании, Голландии. В нашей стране изомеризацию глюкозы в фруктозу ведут в реакторе при помощи глюкозоизомеразы из Actinomyces olivocinereus, иммобилизованной на силохроме. Глюкозо-фруктозная смесь является очень важным продуктом для больных сахар­ным диабетом.

Иммобилизованные ферменты широко применяют для синтеза аминокислот. Так, в 1974 г. в Японии начат промышленный синтез L-аспарагиновой кислоты с участием фермента аспартат-аммиаклиазы, иммобилизованной на фенолоформальдегидной смоле. Фермент осуществляет образование L-аспарагиновой кислоты из аммония и фумаровой кислоты. L-Триптофан синтезируют из ин­дола и серина при помощи фермента триптофансинтетазы, L-тирозин — с участием иммобилизованной тирозин-феноллиазы.

Иммобилизованные ферменты применяют для производства антибиотиков и гормональных препаратов.

Для производства некоторых продуктов удобнее пользоваться не иммобилизованными ферментами, а иммобилизованными микробными клетками — продуцентами ферментов. Так, этанол получают из глюкозы при помощи иммобилизованных в полиак- риламидном геле клеток Saccharomyces cerevisiae. Первый в мире промышленный реактор проточного типа объемом 1 т по синтезу L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония был запущен в Японии (1973). В нем использованы иммобилизованные в полиак- риламидном геле клетки кишечной палочки (Esherichia coli), со­держащие аспартат-аммиак-лиазу:

В этом реакторе можно получать около 2000 кг L-аспарагино- вой кислоты в 1 сут при 95%-ном уровне превращения в нее вве­денного фумарата аммония. При подкислении элюата до рН 2,8 и охлаждении до 15 °с аспарагиновая кислота выделяется в виде кристаллов. Иммобилизованные клетки Е. coli сохраняют актив­ность фермента в течение 4 мес, в то время как интактные клетки только в течение 10 сут.

L-изолейцин синтезируют из треонина и глюкозы при помощи иммобилизованных клеток Serratia marcescens с выходом до 4 г/л элюата с колонки реактора. Таким же образом получают незаме­нимую аминокислоту L-лизин:

При помощи иммобилизованных клеток Corynobacterium glutamicum производят L-глутаминовую кислоту из глюкозы; Е. coli — L-триптофан из индола, Streptococcus faecalis — L-орнитин из L-аргинина. с использованием иммобилизованных микроор­ганизмов синтезируют L-формы аминокислот — аланина, фенилаланина, метионина, треонина. Таким образом, производ­ство L-аминокислот для питания человека и кормления сельско­хозяйственных животных и птиц осуществляют в основном в ре­акторах с иммобилизованными клетками.

Отработаны способы получения яблочной кислоты из фумаровой; пропионовой, уксусной и пировиноградной кислот из глюко­зы, лактозы или лактата натрия в проточной системе с клетками пропионовокислых бактерий, иммобилизованными в полиакрил-амидный гель.

Иммобилизованные ферменты широко применяют для произ­водства различных гормональных препаратов.

В больших количествах производят аспартам — метиловый эфир аспартилфенилаланина:

Аспартам в 300 раз слаще сахара, безвреден, в организме рас­щепляется на аспарагиновую кислоту и фенилаланин; его исполь­зуют для детского питания, добавляют в диетическую кока-колу. Ферменты, синтезирующие аспарагиновую кислоту и фенилала­нин, получены генно-инженерным методом.

Иммуноферментный анализ и его использование в ветеринарии. Для диагностики инфекционных болезней животных применяют различные методы исследований, в том числе серологические и иммунохимические, основанные на реакции антиген—антитело. Главным компонентом иммунохимической реакции являются ан­титела (иммуноглобулины) — белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании чужеродного вещества — антигена. Антитела пред­ставляют собой крупные белковые молекулы, состоящие из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) полипептидных цепей с молекуляр­ной массой 22 000 и 50 000...70 000 соответственно. Различают пять классов иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE, которые отличаются по молекулярной массе, размерам Н-цепей, последо­вательности аминокислот, углеводными компонентами, положе­нию и числу дисульфидных связей. Все гамма-глобулины (антите­ла) имеют вариабельные участки — активные центры антител. Одна молекула антител может иметь несколько активных центров, способных специфически связываться с антигеном. Активный центр обладает уникальной специфичностью, обеспечивающей тесную связь с антигеном, напоминающую соответствие между рукой и перчаткой или ключом и замком.

В качестве антигенов могут выступать белки, полисахариды, а также низкомолекулярные соединения: антибиотики, пестициды. Антитела образуются не против всей молекулы чужеродного бел­ка, а только к небольшим участкам на их поверхности — антиген­ным детерминантам. Антигенными детерминантами белковых мо­лекул чаще всего служат лишь около пяти аминокислотных остат­ков, а в случае бактериальных клеток в качестве антигенных де­терминант выступают короткие цепи из трех—пяти остатков сахаров, образующих стенки бактериальных клеток. Низкомоле­кулярные соединения (гаптены) могут образовать антитела лишь после соединения с макромолекулами.

Для получения специфических иммуноглобулинов (антител) применяют различные методы иммунизации мелких (мыши, мор­ские свинки, кролики, куры) и крупных (овцы, козы, лошади) животных. Принципиально новый метод получения антител — это метод гибридом.

Для диагностики инфекционных болезней разработаны высо­кочувствительные методы — радиоиммунный и иммуноферментный. Радиоиммунный метод требует сложной аппаратуры, радио­активных соединений, в частности ¹²⁵I, что связано с рядом огра­ничений, а потому он неприемлем в обычных условиях.

Иммуноферментный метод не уступает по чувствительности радиоиммунному, его можно использовать в различных лабора­торных условиях, а некоторые варианты могут быть применены непосредственно в условиях животноводческих ферм, например, для определения беременности у коров по уровню содержания прогестерона в молоке. Иммуноферментный метод анализа позво­ляет определить до Ю^-14 моля вещества. Принцип метода заклю­чается в том, что при взаимодействии антигена с антителом полу­чается комплекс антиген—антитело. Количество антигена или ан­титела, вошедшее в комплекс, может быть определено при помо­щи фермента, использованного для мечения антигена или антитела в зависимости от поставленной задачи. Сейчас разрабо­таны сотни различных вариантов иммуноферментного анализа на твердом носителе. В этом случае антитела, иммобилизованные на твердой фазе (на иммунологических планшетах из полистирола), реагируют вначале с искомым антигеном (немеченым), а затем ос­тающиеся свободными иммобилизованные антитела связываются с меченным (ферментом) антигеном. Количество связанного с ме­ченным ферментом антигена обнаруживают при помощи соответ­ствующего субстрата. Здесь фермент играет роль маркера, и ис­пользование его основано на том, что одна молекула фермента производит много молекул продуктов ферментативной реакции, концентрацию которых можно обнаружить обычными физико- химическими методами или же визуально (по изменению цвета). Иммуноферментный метод используют для выявления иммуно­глобулинов, гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, ле­карственных препаратов, пестицидов и т. д.

В целях диагностики инфекционных болезней животных раз­работаны специальные наборы для диагностики классической чумы свиней, бруцеллеза крупного рогатого скота, бешенства, си­бирской язвы, хламидийной инфекции, ротавирусов, инфекцион­ного ринотрахеита и ряда других болезней сельскохозяйственных животных. Использование моноклональных антител делает имму- ноферментный анализ еще более ценным, так как при этом в не­сколько раз повышаются его чувствительность и специфичность.

Контрольные вопросы и задания

1. Дайте определение класса ферментов и их химической природы. 2. Дайте классификацию и номенклатуру ферментов. 3. Что такое активный и аллостери- ческий центры фермента? 4. Каков принцип действия фермента как катализато­ра? 5. Перечислите общие свойства ферментов. 6. Расскажите о сложных фермен­тах и связи витаминов с ферментами. 7. Каковы различия свойств неорганических катализаторов и ферментов? 8. Что такое изоферменты и гетероферменты? 9. Что такое иммобилизованные ферменты и как их используют в медицине, ветерина­рии и т. д.?