Понятие о генотипе и фенотипе, видах изменчивости.

Генотип – это совокупность генов, определяющих способность микроорганизмов к фенотипическому проявлению любого их признака.

Различают истинный генотип и плазмотип.

Истинный генотип – совокупность генов, сосредоточенных в бактериальной хромосоме и отвечающих за проявление жизненно важных признаков и свойств.

Плазмотип – совокупность внехромосомных генов, локализованных в плазмидах и транспозонах и отвечающих за нежизненно важные признаки и свойства, но придающие определенные преимущества перед другими особями популяции (устойчивость к антибиотикам).

Фенотип – это совокупность всех внешних и внутренних признаков микроорганизмов, которые проявляются в данных условиях и данный момент.

Ненаследственная (модификационная, фенотипическая) изменчивость – это временные ненаследуемые изменения признаков или свойств, не затрагивающие генотипа (не сопровождаются изменениями в первичной структуре ДНК) и возникающие под действием факторов окружающей среды.

Модификационная изменчивость не играет существенной роли в эволюции бактерий, так как не приводит к появлению новых видов. По существу это адаптивная (приспособительная) реакция бактерий на изменение условий окружающей среды, позволяющая быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции. Внешне модификации чаще всего проявляются изменениями морфологических и биохимических свойств. При устранении фактора, вызвавшего изменения, бактерия возвращается к исходному фенотипу.

Например:

Способность патогенных бактерий под действием пенициллина или лизоцима образовывать L- формы, у которых отсутствует клеточная стенка, являющаяся мишенью для пенициллина. После устранения пенициллина L-формы переходят в исходный фенотип – начинают синтезировать клеточную стенку.

Ряд ученых к стандартным проявлениям модификационной изменчивости относят диссоциации.

Диссоциации (от англ. dissociation – расщепление) – это своеобразная форма модификационной изменчивости, проявляющаяся в образовании разных типов колоний на плотных питательных средах под воздействии неблагоприятных факторов (неоптимальная температура, рН, старении культуры, действие сывороток и бактериофагов и т.д.).

Это явление характерно прежде всего для энтеробактерий и в основе диссоциаций лежат мутации, приводящие к утрате генов, контролирующих синтез боковых цепей ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

• S-колонии (от англ. smooth – гладкий, ровный) – выпуклые, правильной круглой формы с ровным краем и гладкой поверхностью;

• M-колонии (от лат. mucoid – слизистый) – слизистые, вязкой консистенции, часто с концентрическими кольцами на поверхности;

• D-колонии (от англ. dwarf – карлик) – карликовые, мелкие дочерни колонии вокруг основной;

• L-колонии (названы в честь Листера) – микроскопические колонии с нежным кружевным краем и втянутым в среду центром, нередко коричнево-желтого цвета;

• R-колонии (от англ. rough – грубый, неровный, шероховатый) – неправильной формы с неровным изрезанным краем и шероховатой, изрезанной, морщинистой поверперхностью, сухие, крошащиеся.

Большинство патогенных бактерий изначально существуют в S-форме (исключение возбудители чумы, сибирской язвы и туберкулеза, у которых исходная R-форма), поэтому диссоциации, обычно, протекают в направлении от S к R (при полной утрате способности синтезировать боковые цепи ЛПС клеточной стенки возникают R-формы, при частичной – промежуточные). Обратный переход от R- к S-форме наблюдается крайне редко.

Значение диссоциаций: R-формы более устойчивы к действию факторов окружающей среды.

Наследственная (генотипическая) изменчивость – это изменения фенотипа, сопровождающиеся изменениями в структуре генотипа (первичной структуре ДНК) и передающиеся по наследству.

Генотипическая изменчивость не реверсирует к исходному фенотипу после устранения воздействующего фактора и играет важную роль в эволюции бактерий (появление новых видов). В основе генотипической изменчивости лежат мутации и рекомбинации.

Мутации (от лат. mutation – перемена) – изменения первичной структуры ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или свойства. Мутации приводят к гибели 90-95% клеток популяции, однако выжившие клетки приобретают преимущества перед другими клетками популяции.

Факторы, приводящие к мутациям, получили название мутагенов.

Виды мутагенов:

• физические (УФЛ, температура, магнитные поля, УЗ, ионизирующее излучение);

• химические (акридиновые и анилиновые красители, аналоги азотистых оснований – азотная кислота, нитрофураны, нитрозосоединения – нитрозогуанидин, нитромочевина и др.);

• биологические (бактериофаги, фитонциды, антибиотики – саркомицин). Классификация мутаций:

• По происхождению:

• спонтанные – возникают без видимых вмешательств из вне, т.е. мутагенный фактор остается не установленным (частота ≈ 1:10⁶-10⁹);

• индуцированные – возникают под действием различных известных мутагенов.

• По локализации:

• нуклеоидные (ядерные);

• цитоплазматические (плазмидные).

• По количеству мутировавших генов и характеру изменений в первичной структуре

ДНК:

• генные (точковые) – затрагивают только один ген и обусловлены заменой, выпадением

или вставкой дополнительных оснований:

• простая замена (транзиция) – замена пурина на пурин или пиримидина на пиримидин;

• сложная замена (трансверсия) – замена пурина на пиримидин или наоборот;

• замена одного кодона (аминокислоты) на другой;

• сдвиг рамки считывания, что приводит к изменению всех последующих кодонов (нонсенс мутации);

• возникновение бессмысленных кодонов, что приводит к прекращению трансляции в данной точке;

• хромосомные – затрагивают несколько генов:

• делеции – выпадение фрагмента ДНК;

• инверсии – поворот фрагмента ДНК на 180⁰;

• дупликации – повторение фрагмента ДНК;

• транслокации – перемещение фрагмента ДНК из одной позиции в другую.

• По направленности:

• прямые – первичные мутации;

• обратные – вторичные мутации, возникающие в этом же гене под действием другого мутагена, в результате чего может произойти восстановление исходного фенотипа (если восстанавливается фенотип без восстановления генотипа, мутация называется супрессорной).

• По последствия для мутировавших клеток:

• нейтральная – мутация произошла, а фенотипически не проявляется;

• условно-летальные – частичная утрата признака или свойства;

• летальные – полная утрата признака или свойства, если признак жизненно важный, то клетка погибает.

• По фенотипическому проявлению:

• морфологические – утрата или изменение морфологических структур клетки (форма, капсула, жгутики и др.);

• биохимические – утрата или изменение способности синтезировать ферменты, аминокислоты и т.д.

Механизм мутаций – известно большое количество мутагенов, что обуславливает многообразие механизмов мутаций, например:

• УФЛ приводят к образованию тиминовых димеров в ДНК (прочных связей между соседними тиминами в одной и той же цепи), которые препятствую работе ДНК-полимеразы, нарушая тем самым репликацию ДНК;

• ионизирующее излучение вызывает одноцепочечные разрывы ДНК;

• акридиновые красители вызывают выпадения или вставки оснований;

• азотистая кислота приводит к дезаминированию азотистых оснований с заменой гуанин+цитозин на аденин+тимин (транзиция) и т.д.

Мутации, приводящие к повреждению исходной структуры ДНК, теоретически, должны привести к вымиранию бактериальной популяции. Однако на практике этого не происходит. Почему? Оказывается, иммунитет существует не только на уровне целостного организма, но и на уровне клетки. Здесь он направлен на защиту (восстановление) самого ценного, что имеется в клетке

• ее генома. Процесс восстановления поврежденной ДНК получил название – репарация.

Репарация – это процесс восстановления поврежденной в результате мутации ДНК с помощью специальных ферментативных систем.

В настоящее время известно три основных направления восстановления поврежденной ДНК:

• непосредственная прямая реверсия от поврежденной ДНК к исходной структуре (фотореактивация);

• выпадение (эксцизия) повреждений с последующим восстановлением исходной структуры ДНК (эксцизионная темновая репарация и эксцизионная репарация, опосредованная ДНК- гликозилазой);

• активация механизмов, обеспечивающих устойчивость к повреждениям (пострепликативная рекомбинационная репарация – обеспечивает репарации в процессе рекомбинаций, SOS-репарация – склонная к ошибкам: восполнение дефекта наугад, хаотично, поэтому характерны ошибки, mismatch-репарация – корригирует ошибочные пары оснований).

На сегодняшний момент наиболее изучены фотореактивация и темновая репарация.

Фотореактивация (световая, пострепликативная репарация) – открыта Келнером в 1949 г., представляет собой наиболее простой механизм, действие которого может распространяться даже на одноцепочечную ДНК. Протекает в одну стадию на свету: при облучении видимым светом происходит активация фермента – фотолиазы, которая расщепляет пиримидиновые димеры до мономеров.

Фотореактивация характеризуется высокой специфичностью и полным восстановлением исходной структуры ДНК без дополнительных ее изменений.

Эксцизионная темновая (дорепликативная) репарация – протекает в несколько стадий без участия света, т.е. в темноте:

1. Вырезание и удаление (расщепление) поврежденного участка ДНК с помощью эндо- и экзонуклеазы.

2. Зачистка прилегающих участков и восстановление удаленного участка по матрице второй нити ДНК с помощью ДНК-полимеразы I.

3. Сшивание вновь синтезированного участка с исходной цепью ДНК с помощью лигазы. Микроорганизмам, как и клеткам высших организмов свойственны генетические рекомбинации, но у прокариот они имеют свои особенности, зависящие от способа размножения и

закономерностей передачи генетического материала.

Рекомбинационная изменчивость – это генотипическая изменчивость, возникающая при встраивании чужеродной ДНК в генном клетки-хозяина (суть – это односторонний обмен генетическим материалом между донором и реципиентом, отличающихся друг от друга по одному или нескольким признаком, для создания нового индивидуума – рекомбинанта, наделенного свойствами и донора и реципиента).

Если генетические рекомбинации у эукариот совершаются в ходе полового размножения с образованием двух рекомбинантных особей, то прокариотам не свойственно половое размножение и

рекомбинации у них приводят к образованию только одной рекомбинантной особи, геном которой представлен геномом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора.

Передача генетического материала от одной бактерии другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации.

Трансформация (впервые открыта Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с живыми авирулентными (бескапсульными) и убитыми вирулентными (капсульными) пневмококками на белых мышах) – это непосредственная передача генетического материала (предварительно выделенной и очищенной ДНК) от одной бактерии (донор) другой (реципиент) / изменение свойств одной бактериальной клетки под влиянием ДНК, выделенной из другой бактериальной клетки.

Трансформация происходит только в опытах с бактериями одного и того же вида, имеющих разный генотип.

Условия трансформации:

• клетка реципиента должна быть компетентной (иметь на поверхности клеточной стенки рецепторы для адсорбции и проникновения донорской ДНК);

• донорская ДНК должна иметь молекулярную массу не менее 10⁶ D;

• наличие двойной спирали ДНК;

• наличие в ДНК донора и реципиента гомологичных участков.

Фазы трансформации:

1. Адсорбция двуцепочечной ДНК донора на рецепторах компетентной клетки- реципиента и ферментное расщепление связавшейся ДНК с образованием фрагментов с молекулярной массой 4-5×10⁶ D.

2. Проникновение фрагментов ДНК донора в клетку-реципиента с разрушением одной из цепей.

3. Соединение ДНК донора с гомологичным участком хромосомы реципиента.

Трансдукция (открыта Н. Циндером и Д. Ледербергом в 1951 г.) – это передача генетического материала от одной бактерии (донор) другой (реципиент) с помощью дефектных бактериофагов (умеренный бактериофаг, у которого в процессе репродукции в момент сборки фаговых частиц в головку вместе с фаговой ДНК проникает какой-либо фрагмент донорской ДНК и при этом утративший часть своего генома).

Различают три типа трансдукции:

• специфическая – бактериофаги переносят от бактерии-донора к бактерии- реципиенту строго определенные гены (гены, расположенные на хромосоме клетки-донора рядом с профагом) и могут встраиваться только в строго определенный локус хромосомы бактерии- реципиента;

• неспецифическая (генерализованная) – вместе с фаговой ДНК в клетку- реципиент могут быть перенесены любые гены донора, способные встраиваться в любую точку ДНК;

• абортивная – принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать (при делении бактериальной клетки фрагмент ДНК донора передается только одной из двух дочерних клеток и в конечном итоге утрачивается).

Конъюгация (1946 г. Д. Ледерберг и Э. Тейтмут) – это непосредственная передача генетического материала от донора к реципиенту через конъюгативные мостики (пили II типа).

Клетке-донору необходимо наличие F-плазмиды (полового фактора). Бактерии, не имеющие F- плазмиды, являются реципиентами.

Этапы конъюгации автономных плазмид:

1. Прикрепление клетки-донора к клетке-реципиенту при помощи половых ворсинок.

2. Образование между клетками конъюгативного мостика.

3. Передача через конъюгативный мостик от донора к реципиенту F-плазмиды и других плазмид, находящихся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии.

При переносе F-плазмиды в состоянии Hfr (интегрированном в хромосому) сначала происходит разрыв одной из цепей ДНК при помощи эндонуклеаз, дистальный конец которой проникает в клетку-реципиента через конъюгативный мостик и достраивается до двунитевой. Оставшаяся в клетке донора неповрежденная нить ДНК служит матрицей для восстановления поврежденной нити.

В этом случае частота переноса полового фактора очень низкая, а частота образования рекомбинантов – высокая, т.к. реципиенту передаются только гены бактериальной хромосомы.