Определение чувствительности бактерий к антибиотикам.

Определение чувствительности выделенных культур возбудителя к антибиотикам, является необходимым элементом бактериологического исследования и обязательным условием антибиотикотерапии. Это относится, прежде всего, к следующим группам заболеваний:

1. Сепсис, эндокардит, менингит, остеомиелит.

2. Хронические инфекции ВДП, ЖКТ, МПС.

З. Внутрибольничные инфекции, раневые, гнойные.

А. Метод стандартных бумажных дисков.

Величины зон задержки роста:

• диаметр от 0 мм до 6 мм – устойчивые;

• диаметр от 7 до 15мм – слабочувствительные;

• диаметр от 16 мм до 24 мм – чувствительные;

• диаметр от 25 мм и более – высокочувствительные.

Метод дает только качественную характеристику, однако прост и доступен в исполнении.

Б. Метод серийных стандартных разведений – позволяет определять минимальную подавляющую (ингибирующую) концентрацию антибиотика.

В. Экспрессный рэдокс-метод – основан на улавливании изменения ОВП питательной среды микроорганизмами по изменению цвета индикатора, добавленного в питательную среду (подолжительность определения 3-5 часов).

Д. ПЦР – выявление у микроорганизма генов устойчивости.

Г. Е-тест – применяют бумажные полоски, пропитанные рядом убывающих концентраций определённого антибиотика (128, 64, 32, 16, 8... мкг/мл), после инкубирования вокруг полоски образуется эллипсовидная зона задержки роста.

Определение концентрации антибиотиков в биологических жидкостях.

Для определения концентрации антибиотиков в моче, крови и других биологических жидкостях используют метод, основанный на способности антибиотиков диффундировать в агар, зараженный тест-микробом и подавлять рост последнего. Зона подавления роста тест-микроба зависит от концентрации антибиотика в изучаемом субстрате. Диаметры полученных зон сравнивают с величиной зон, образующихся при нанесении на агар известных количеств стандартного препарата (стандартами служат специально приготовленные очищенные образцы антибиотиков, активность которых установлена по международным стандартам).

Тема лекции: «Генетика бактерий»

Генетика – это наука, изучающая закономерности наследственности и изменчивости живых организмов, в том числе и микроорганизмов.

Наследственность – это свойство живого организма (в том числе и микроорганизма) передавать потомству признаки и особенности развития родителей (видовые признаки).

Изменчивость – это свойство живого организма (в том числе и микроорганизма) изменяться (изменять видовые признаки), обеспечивая разнообразие живого как на уровне одной отдельной клетки, так и на уровне вида.

Исторические этапы становления генетики микроорганизмов.

1. Эвристический (донаучный) период.

Судя по археологическим данным, 6000 лет назад надписи на глиняных табличках гласили:

«физические признаки могут передаваться от одного поколения другому»; в частности, вавилонские глиняные таблички указывают на возможные признаки при скрещивании лошадей, улучшение породы других животных и сортов растений.

1. Эмпирический (научный) период (середина XIX века).

Исходной точкой становления генетики как науки послужили труды Г. Менделя. В 1865 г.

австрийский монах Грегор Мендель обнародовал труды по скрещиванию сортов гороха:

«наследственные признаки не смешиваются, а передаются от родителей к потомкам в виде обособленных (дискретных) единиц». Однако эти работы настолько опередили развитие биологии того времени, что оказались невостребованными.

Однако корни генетики бактерий берут свое начало от первых попыток систематики бактерий. Работы Л. Пастера и Р. Коха побудили открытие новых микроорганизмов, необходимо было их систематизировать, то есть сопоставить сходные признаки и различия. И здесь мнения ученых разделились. Существовало мнение полиморфистов (плеоморфисты), которые считали, что все свойства бактерий изменяются, и мономорфистов, которые утверждали, что свойства микроорганизмов неизменны. После длительной дискуссии победу одержали плеоморфисты, а результаты почти векового спора двух направлений послужили основой для генетики бактерий.

2. Классический период (начало XX века).

В 1900 г. К. Корренс, Э. фон Чермак, Г. Де Фриз в работах по гибридизации бактерий переоткрывают законы Менделя, которые к тому времени были забыты. С этого момента начинается бурное развитие генетики высших организмов (растений, животных).

В 1903 г. Иогансен предложил термин «ген». В 1906 г. Бетсон дал определение «генетики».

В 1925 г. Надсон, Филипов изучили действие рентгеновских лучей на дрожжи, в 1927 г. изучены термические мутации.

В 1928 г. Фредерик Гриффитс обнаружил молекулу наследственности, которая передается от бактерии к бактерии.

3. Период молекулярной генетики (с середины XX века).

Основные открытия в генетике бактерий приходятся на середину XIX века, когда у ученых появилась возможность не просто систематизировать сведения об изменчивости и наследственности, но и расшифровать их «тонкие» механизмы. В этот период была проведены расшифровка структуры ДНК, триплетного кода, описание механизмов синтеза белка, обнаружение рестриктаз и секвенирование ДНК.

В 1944 г. О. Эвери, К. Мак Леод, М. Мак Карти изолируют ДНК, осуществив трансформацию бескапсульных пневмококков в капсульные in vitro, тем самым доказав, что материальной единицей наследственности (генетическим материалом) у бактерий является ДНК.

В 1952 г. Чейз доказывает, что генетическая информация бактериофагов содержится также в

ДНК.

В 1953 г. Ф. Крик, Д. Уотсон смоделировали структуру и репликацию ДНК, обосновали

приложимость этой модели к наследственности и изменчивости микроорганизмов.

В 40-50 гг. – были выявлены системы рекомбинации у бактерий: трансдукция, трансформация и конъюгация. Затем открыты внехромосомные факторы наследственности: плазмиды, транспозоны, Is-элементы и т.д.

В 1958 г. Шталь доказал, что удвоение ДНК у бактерий носит полуконсервативный характер.

В 1961 г. Ф. Крик, Бернет и Д. Уотсон сформулировали общие принципы организации генетического кода на примере генетического кода E. coli (код является триплетным, вырожденным и неперекрывающимся).

В 1970 г. у бактерий палочки инфлюэнцы обнаружены ферменты рестриктазы. В 1977 г. лаборатория Зангера полностью секвенировала геном бактериофага.

В 1983 г. Кэри Мелис открывает ПЦР для простой и быстрой амплификации ДНК.

В 1995 г. полностью секвенирован геном организма невирусной природы – бактерии Haemophylus influenzae.

В 1996 г. впервые секвенирован геном пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). В 1998 г. секвенирован геном многоклеточного организма – нематоды.

В 2001 г. сделаны первые «наброски» полной последовательности генома человека. В 2003 г. секвенировано 99% генома человека.

В настоящее время развивается биотехнология, инженерная энзимология – использование микробных ферментов на носителе (разработан препарат иммобилизованная стрептокиназа –

«стрептодеказа», который вводят в сосуд для растворения тромба; растворимая в воде полисахаридная матрица с привязанной стрептокиназой повышает устойчивость фермента, снижает его токсичность, аллергическое действие, повышает способность растворять тромбы). Бурными темпами развивается клеточная инженерия (гибридомы), тканевая инженерия (способ получения

кератоноцитов), генная инженерия (получен промышленный штамм микроорганизма- сверхпродуцента, синтезирующего аминокислоту «треонин» для добавления в корм животным с целью наращивания мышечной ткани).