Методы разделения смесей белков. Значение хроматографического иэлектрофоретическогоисследованиябелковплазмыкрови.Белковыефракцииплазмыкрови,причиныих изменения.

Хроматография- процесс разделения веществ, находящихся в смеси или растворе, насоставляющие компоненты в системе двух фаз, одна из которых неподвижна, а другаяперемещаетсяотносительнопервой.Перемещениеспособствуетмиграциивеществ,приэтомнеподвижная фаза не изменяется, а каждый компонент движется независимо от других ссобственнойскоростью.

Хроматографическиеметодыприменяютдлясорбционно-динамическогоразделениясмесиаминокислот,белков, углеводов,липидовиихметаболитов.

Взависимостиотприродыадсорбентаимеханизмаразделениявеществхроматографиюподразделяютнанескольковидов:

1. Адсорбционная –основана на различной способности отдельных компонентовсмеси (в силу их различной полярности) адсорбироваться на поверхности твѐрдойфазысорбента.

2. Распределительная– основана на различной растворимости разделяемых веществв двух малосмешивающихся жидкостях; в отличие от адсорбционной, твердая фазаслужит опорой (основой) для стационарной (неподвижной) фазы. Разновидностьюраспределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широкоиспользуемаявбиохимическихиклиническихлабораторияхдляразделениябелков,пептидов,аминокислоти другихвеществ.

3. . Ионообменная– основана на различной способности разделяемых веществ кобменуихионовнаионынеподвижнойфазысорбента.Вкачественеподвижнойфазысорбента применяются ионообменные смолы..В зависимости от заряда разделяемыхбелковиспользуютподходящуюионообменнуюсмолу,сфункциональнымигруппамикоторойобмениваетсячастьбелковизадерживаетсянаколонке,втовремякакдругиебелкибеспрепятственно выносятсяиз колонки.

4. Диффузионная–основананаразделениивеществпоскоростидиффузиивнутрьсорбента в зависимости от размера молекул. К данному типу относится гель-фильтрация - разделение веществ, основанное на механическом явлениимолекулярных сит (просеивания). Этот метод широко используется при очисткебелковотпримесейидляфракционированиябелковплазмы.

5. Аффинная (хроматография сродства) –основана на принципе избирательноговзаимодействиябелков(илидругихмакромолекул)соспецифическимивеществами–лигандами,закрепленными наносителе

Электрофорезбелков

Метод основан на том, что при определѐнном значении рН и ионной силы раствора белкидвигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду.Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительнозаряженныебелки-ккатоду(-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле,полиакриламидномгелеи др

Значение

Дляопределениябелковогосоставасывороткикровииспользуютметодэлектрофореза[12].При циррозе печени содержание альбумина снижено. При остром гепатите эти изменениявыраженызначительноменьшеит.д.Используютдлядиагностикимногихзаболеваний.

Применение распределительной хроматографиидля изучения химии и обмена аминокислоти белков имеет наибольшее значение, так как с ее помощью удается разрешить труднейшиезадачиразделения,идентификацииивыделенияиндивидуальныхаминокислотипептидовизихсмесей.

Белковыефракции–количественноесоотношениефракцийобщегобелкасывороткикрови:альбуминов,α-1-глобулинов,α-2-глобулинов,β-глобулиновиγ-глобулинов

Фракцияα-1-глобулиноввключаетвсебя

• альфа-1-антитрипсин(основнойкомпонентэтойфракции)–ингибиторпротеолитическихферментов,

• альфа-1-кислыйгликопротеин(орозомукоид)–обладаетширокимспектромфункций,взоневоспаленияспособствует фибриллогенезу,

• альфа-1-липопротеины(функция–участиевтранспортелипидов),протромбинитранспортныебелки

Фракцияα-2-глобулиновпреимущественновключаетбелкиостройфазы:

• Альфа-2-макроглобулин,являющийсяосновнымкомпонентомфракции,участвуетвразвитииинфекционныхи воспалительныхреакций.

• Гаптоглобин–этогликопротеин,которыйобразуеткомплекссгемоглобином,высвобождающемсяизэритроцитовпривнутрисосудистомгемолизе.

• Церулоплазминспецифическисвязываетионымеди,атакжеявляетсяоксидазойаскорбиновой кислоты, адреналина, диоксифенилаланина (ДОФА), способенинактивироватьсвободныерадикалы.

Фракцияβ-глобулиновсодержит:

• трансферрин(главныйплазменныйбелок–переносчикжелеза),

• гемопексин(связываетгемм/метгем,вследствиечегопредотвращаетвыведениеегопочкамии потерю железа),

• компонентыкомплемента(которыеучавствуютвреакцияхиммунитета),

• бета-липопротеины(принимаютучастиевтранспортехолестеринаифосфолипидов)

• частьиммуноглобулинов.

Фракцияγ-глобулиновсостоитизиммуноглобулинов(соответственнопорядкуколичественного убывания–IgG,IgA, IgM,IgE)

Изменениесоотношениябелковыхфракцийплазмыкровинаблюдаетсяпримногихзаболеванияхпринормальномсодержанииобщегобелка(диспротеинемии)

Характерныевариантысдвиговсодержаниябелковыхфракций.

Острофазныйответ(изменения,связанныесвоспалениеминекрозомтканей)–повышение

содержания α-1- и α-2-глобулинов. Наблюдается при острой вирусной инфекции, остройпневмонии, остром бронхите, остромпиелонефрите,инфаркте миокарда, травмах (включаяхирургические),новообразованиях.

Хроническоевоспаление–увеличениесодержанияγ-глобулинов(ревматоидныйартрит,хронический гепатит).

Нефротическийсиндром–повышениеконцентрациивкровиα-2-глобулинов.

Циррозпечени–значительноеувеличениебелковгамма-фракции.