36. Полимеразная цепная реакция (пцр): принцип метода, компоненты, постановка реакции, цели применения, достоинства и недостатки метода.

ПЦР основан на размножении в пробирках уникальных участков генов вируса или бактерий в миллионы и миллиарды раз за 2-3 ч при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Метод получил название ПЦР от англ. Polymerase Chain Reaction, PCR.

Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. Амплифицируемый участок именуют амплификоном. Его границы определяются двумя олигонуклеотидными праймерами (затравками) – отрезки одноцепочечной ДНК длиной 20-30 нуклеотидов, комплементарные каждой из цепей ДНК-матрицы и служащие затравкой для синтеза новой цепи ДНК, комплементарными определенным последовательностям в составе противонаправленных нитей двухцепочной ДНК

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК (рисунок 43).

Из рисунка видно, что каждая из вновь синтезированных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера. Для этого надо лишь денатурировать (цепи ДНК расходятся) образовавшиеся в результате первой стадии реакции двухцепочной молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить с помощью ДНК-полимеразы элонгацию (синтез ДНК-достройки праймера).

Эти три стадии:

• денатурация ДНК (плавление);

• комплементарное связывание праймера с ДНК-матрицей (отжиг);

• синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы (достройка праймера) и составляют суть каждого цикла ПЦР.

Далее этот стандартный цикл ПЦР плавление, отжиг, синтез воспроизводится многократно, и в идеале количество амплификонов растет в геометрической прогрессии.

Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК амплификонов в количестве, достаточном для дальнейшего исследования или индикации. Индикация может быть произведена электрофорезом с окрашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно меченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуорометрическим, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых предшественников синтеза НК.

Основными компонентами ПЦР являются:

• фермент Taq-ДНК-полимераза;

• пара олигонуклеотидных праймеров;

• четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов.

Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло.

ДНК-полимеразы выдерживают многократный нагрев до 90 °С, что позволяет проводить реакции в амплификаторе (amplification англ. умножение, усиление) приборе, обеспечивающем поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени (рисунок 44). TaqДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в 1 мин. Кроме того, возможности пцр в идентификации днки рнк-содержащих вирусов еще больше возросли с выделением новой полимеразы (из термофильного микроорганизма Thermus thermophilus), обладающей как полимеразной, так и обратнотранскриптазной активностью. С помощью этого фермента упрощается выявление РНК-содержащих вирусов в ПЦР.

Праймеры для ПЦР имеют длину 20-30 нуклеотидов, должны быть комплементарны выбранному месту в матрице. Особенно жесткие требования предъявляются к комплементарности 3'-концевой части праймера, в то время как в средней и 5'-концевой его части допустимы нуклеотидные замены. Чем больше нуклеотидов в праймере, тем специфичнее ЦПР; короткие праймеры часто «ошибаются».

Дезоксинуклеозидтрифосфаты: дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ в реакционной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.

Магний необходим для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы.

Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермента. Наиболее распространен трис-НС1-буфер (рН6,8-7,8), содержит желатин или бычий сывороточный альбумин и неионные детергенты для стабилизации фермента.

Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси для предотвращения испарения в процессе ПЦР.

ПЦР удобна для изучения и диагностики наследственных и вирусных заболеваний, когда серологические тесты или культивирование вируса затруднены или малоэффективны, когда вирус имеет высокую антигенную изменчивость, что осложняет применение иммунологических методов диагностики.

Достоинства ПЦР:

• быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при параллельной обработке 10-12 образцов;

• надежность анализа. Под этим подразумевается защищенность от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. При аккуратной работе с образцами и реактивами, при использовании всех контролей, надежного оборудования и жестко стандартизированных реактивов методы диагностик вирусных инфекций, основанные на ПЦР, являются высоконадежными;

• чувствительность анализа наименьшая концентрация клеток или вирусных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется сочетанием следующих 3-х факторов: эффективного выделения НК возбудителя, чувствительности собственно ПЦР и чувствительности выбранного метода индикации. ПЦР позволяет достичь предельно возможной чувствительности: от нескольких копий до одного возбудителя в пробе;

• специфичность анализа 100 % выявление возбудителей конкретного вида, рода на фоне других вирусов и клеток организма-хозяина.

• пригоден любой материал, гистологические препараты;

• количество исследуемого материала составляет несколько десятков микролитров;

• метод позволяет определить число копий возбудителя в пробе и тем самым контролировать вирусемию или бактериемию в процессе лечения;

• исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР;

• простота исполнения и возможность полной автоматизации.

ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших размерах. Необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы ПЦР генодиагностической лаборатории.

Эта реакция успешно используется при диагностике вирусной диареи, чумы, ИРТ КРС, ящура, чумы свиней, болезни Ауески, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц и др.

ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ