10.Цели использования в вирусологии лабораторных животных, их виды, требования к ним, животные-гнотобиоты, спф-животные. Латентные инфекции лабораторных животных.

Полученный от зараженного животного вируссодержащий материал считают выделенным вирусом.

В организме экспериментально зараженных животных вирус накапливается. Это используют для его изучения, идентификации, для получения гипериммунных сывороток или для получения противовирусных вакцин.

Пассаж заражение чувствительной живой системы с целью получения от нее новой популяции вируса. Такой вирус снова хранят в консервирующих условиях.

При работе с вирусом необходимо знать его инфекционный титр, т.е. его концентрацию в материале. Ее можно определить заражением чувствительных к исследуемому вирусу живых систем (в том числе лабораторных животных) разными разведениями вируссодержащего материала.

Виды лабораторных животных: кролики, морские свинки, белые крысы, белые мыши, золотистые хомячки; куры, голуби, котята, щенки и т.д. При особо чувствительных вирусах: МРС, КРС, свиньи и т.д. Так, биопробу при оспе птиц ставят на курах, оспе овец на овцах, чуме свиней на подсвинках.

Требования к лабораторным животным.

1. чувствительность к вирусу;

2. возраст животного;

3. линейные животные это животные, полученные в результате близкородственного скрещивания в течение ряда поколений, такие животные становятся настолько генетически однородными, что и их реакция на то или иное воздействие будет одинаковой;

4. лабораторные животные должны быть здоровы. Животные, поступающие в виварий вирусологической лаборатории, должны быть привезены из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Их содержат изолированно, т.е. в карантине (белых мышей и крыс 14 дней, а остальных животных 21 день).

Животные-гнотобиоты свободные от микроорганизмов, получают и выращивают их в стерильных условиях для экспериментальных работ. Гнотобиотами называются также стерильные животные, специально заражённых определёнными видами микроорганизмов. Применяют в производстве высокоспецифических диагностических сывороток, при испытании фармакологических и биологических препаратов.

СПФ-животные животные без специфических патогенных факторов, лишённых патогенных микробов.

Среди лабораторных животных могут быть распространены латентные инфекции (характеризуются тем, что возбудитель постоянно находится в организме, но не проявляет себя клинически). При снижении резистентности организма, возбудитель бурно размножается и вызывает клинику болезни. Из латентных инфекций лабораторных животных вирусной этиологии значительное распространение имеет эктромелия белых мышей, вирусные пневмонии, нейроинфекции.

11.Методы экспериментального заражения лабораторных животных, признаки размножения вируса в их организме, "слепые пассажи".

Пассаж заражение чувствительной живой системы с целью получения от нее новой популяции вируса. Такой вирус снова хранят в консервирующих условиях.

Метод контроля животных на носительство возбудителей латентных инфекций: готовят суспензии из отдельных органов животных, специально убитых для этой цели, и вводят их соответствующими методами животным того же хозяйства (например, суспензию из мозга вводят интрацеребрально). При наличии латентной инфекции проведенный таким образом пассаж вируса приведет к острому течению болезни.

Уход за животными и их содержание. Придерживаются двух правил:

1. Необходимо обеспечить функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы.

2. Исключить взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария.

Животных содержат в виварии с учетом норм зоогигиены. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой. Уборку помещения и кормление начинают со здоровых. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Обслуживающий персонал при работе в виварии пользуется спецодеждой: халатом, резиновыми перчатками, фартуком, непромокаемой обувью. В виварии ежедневно дезинфицируют инвентарь и проводят влажную уборку с применением дезвеществ. По окончании эксперимента клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.

Техника безопасности при работе с лабораторными животными. Источником инфицирования людей могут служить экспериментально зараженные животные и их эктопаразиты. Профилактика заражения людей от животных проводится с учетом пути передачи возбудителя. Контроль за состоянием здоровья сотрудников лаборатории ведет медицинская служба. При работе в лаборатории с вирусами бешенства, клещевого энцефалита, инфекционного гепатита и некоторыми другими инфекциями сотрудникам делают прививки против этих болезней.

Метка лабораторных животных. Бирка с надписью (использованный для заражения вирус или номер экспертизы исследуемого патматериала, количество зараженных животных, дату заражения и, если надо, другие сведения).

Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Бирки надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу окольцовывают (курам).

При использовании в эксперименте небольшой группы животных и при непродолжительном сроке можно выстригать шерсть знаками на спине, бедрах (у кроликов). Морских свинок можно различать по окраске, которую регистрируют в рабочем журнале.

Метка белых мышей, белых крыс может быть проведена ампутацией отдельных пальцев на передних или задних конечностях, каждый из которых соответствует тому или другому порядковому номеру: на передних лапах единицам, на задних десяткам. Однако чаще пользуются методом нанесения цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей (растворов фуксина, бриллиантовой зелени) удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставятся в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если тело животного мысленно разделить на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесение цветных пятен начинают с левого верхнего угла, т. е. лопатки, и это будет соответствовать 1. Тогда, двигаясь назад, левый бок соответствует 2, а левое бедро 3, далее затылок 4, спина 5, область репицы 6, правое плечо 7, правый бок 8, правое бедро 9. Используя два цвета красителей, можно дать обозначения одним из них единиц, другим десятков.

Методы экспериментального заражения лабораторных животных (рисунок 1). Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса (способность репродуцироваться в определенных типах клеток организма). Вирусы, репродуцирующиеся в нервных клетках, называются нейротропными (вирус бешенства), репродуцирующиеся в клетках кожи – дермотропными (вирус оспы), в клетках легких – пневматропными (вирус гриппа). Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются политропными (вирус ИРТ КРС в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток пантропными (вирус чумы собак). Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. При отсутствии данных о тропизме вируса, заражение проводят разными методами.

Объем заражающей дозы материала варьирует в зависимости от метода внесения и вида животных.

Способы фиксации у разных животных свои. Кроликов удерживают за кожу спины ближе к лопаткам, а другой рукой придерживают заднюю часть тела. Такая фиксация предотвращает получение царапин. Морских свинок держат одной рукой за грудь, а другой за задние лапы. Крыс и мышей берут за хвост, дают им возможность уцепиться передними конечностями за металлическую сетку (клетки), захватывают двумя пальцами левой руки кожу на затылке и слегка растягивают животное. При этом крыс прочнее и безопаснее фиксировать корнцангами (рисунок 1), а для большей надежности голову животного можно удерживать двумя корнцангами за щечные кожные складки. Оба этих корнцанга помощник держит в левой руке, а корнцанг, фиксирующий хвост, в правой. Белых мышей без помощника фиксируют, захватывая складку кожи между ушами пинцетом Пеано, который, в свою очередь, укрепляют на стоящую в обычном штативе пробирку. Возможна фиксация мышей и одной рукой.

Перед заражением место введения материала тщательно обрабатывают 3 % спиртовым раствором йода.

Методы заражения лабораторных животных:

Подкожный метод кожную складку, захваченную большим и указательным пальцами левой руки, приподнимают и в ее основание параллельно поверхности тела вводят иглу со шприцем. Местом инъекции у большинства животных область спины, бока, плеча, лопатки и реже боковой стенки грудной клетки (собака), коленной складки (морская свинка), шеи (куры).

Внутрикожный метод у кроликов на боку или животе выстригают, а затем выбривают шерсть на участке кожи. Подготовленное поле протирают спиртом и физраствором. Иглу шприца скосом наружу вводят под острым углом в толщу поверхностного слоя кожи на несколько мм. Материал инъецируют до приподнимания слоя кожи в виде бугорка. Мелким животным в/к вводят материал в плантарную поверхность задней конечности, которую фиксируют, отводя ее назад и помещая на указательный палец левой руки. Правой рукой иглу со шприцем вводят в кожу в направлении от пальцев к голеностопному суставу.

Для размножения в организме дермотропных вирусов материал втирают в скарифицированную кожу. На коже, подготовленной, как и для внутрикожного заражения, делают несколько поверхностных царапин иглой или обломленной пастеровской пипеткой до появления капелек лимфы. Затем наносят материал и втирают его шпателем, стеклянной палочкой или остриженной зубной щеткой. Заражение в скарифицированную кожу у крупных животных проводят на боку или животе, у морской свинки на плантарной поверхности ступни, у мелких животных в области спины, у петухов в гребень и сережки, а также в перьевые фолликулы голени сразу же после удаления перьев.

Внутримышечный метод выбирают мышцы бедра, а у кур большую мышцу груди. Иглу после дезинфекции места инъекции вводят через кожу и подкожную клетчатку в мышцы, направляя перпендикулярно к поверхности тела. После инъекции материала иглу извлекают, место введения повторно дезинфицируют.

Внутрибрюшинный метод животное фиксируют вертикально вниз головой для того, чтобы органы брюшной полости сместились к диафрагме и при введении материала игла не травмировала кишечник. В области паха, а у кур на середине расстояния между верхушкой грудной кости и клоаки короткую иглу вводят сквозь кожу и брюшинную складку, направляя под углом 45 ° к продольной оси тела. При этом левой рукой слегка оттягивают лапу животного, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки со стороны инъекции. Проникновение иглы ощущается по исчезнувшему сопротивлению брюшной стенки. Мышам в/б можно вводить 0,2-8,0 мл раствора.

Внутривенный метод важно контролировать, чтобы в вену из шприца не попали пузырьки воздуха или частицы материала, которые могут вызвать эмболию и гибель животного. Белых мышей и крыс заражают в боковые вены хвоста, предварительно расширив их, растирая тампоном, смоченным тампоном, смоченным ксилом или горячей водой. Помощник левой рукой сдавливает хвост у корня, а правой фиксирует животное за кожу затылка. Иглу скосом наружу вводят под острым углом в вену нижней трети хвоста, где кожа тоньше, и направляют к корню хвоста. Если игла попала в сосуд, го жидкость легко поступает из шприца, а сосуд на всем протяжении бледнеет. Освободив вену у корня хвоста, медленно вводят материал. Затем вену передавливают ниже места вкола, иглу извлекают, и место инъекции прижимают сухой ватой. Если вводимый раствор проталкивается с трудом, хвост набухает, то жидкость из шприца попала под кожу, а не в вену. Морским свинкам можно ввести вирус в ток крови, только проникнув иглой в сердце. Для этого определяют место сердечного толчка, в межреберный промежуток слева и на 1 см выше мечевидного отростка вводят иглу без шприца. Если в игле покажется кровь, значит, игла попала в сердце, и тогда, присоединив шприц, инъецируют материал. Кроликам в/в материал вводят в краевую вену уха, предварительно удалив волосы на месте инъекции и пережав сосуд ниже вкола иглы. Игла должна быть направлена по ходу тока крови, т.е. к голове. Птице вируссодержащий материал вводят в подкрыльцовую вену.

Интраназальный метод большинство лабораторных животных (за исключением кроликов) при закапывании материала в ноздри чихают и разбрызгивают вируссодержащую суспензию. Поэтому перед и/н заражением животным делают глубокий эфирный наркоз (помещают в банку с крышкой и кусочком смоченной эфиром ваты). Заснувших животных извлекают, фиксируют вверх ноздрями. Материал по каплям вводят в ноздри, и с вдыхаемым воздухом он втягивается внутрь. Кроликам вируссодержащую суспензию закапывают в ноздри по каплям при запрокинутой на спину голове без наркоза.

Интрацеребральный метод кожу головы мышат большим и указательным пальцами левой руки оттягивают к затылку. Иглой шприца с ограничителем прокалывают кожу и череп на глубину 1-2 мм в точке, лежащей в центре квадрата, образованного средней сагиттальной линией и перпендикуляром к ней, походящим по наружному краю глазниц. Белых крыс и/ц заражают через трепанационное отверстие, а молодых кроликов и морских свинок прокалывая кости черепа в надглазничной борозде, где кость довольно тонкая. Иглу используют с ограничителем, обеспечивающим проникновение иглы не более чем на 4-5 мм. Старых животных и/ц заражают через трепанационное отверстие.

После заражения животных помещают в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы исследуемого материала, количества и номеров зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают название вируса или номер экспертизы исследуемого материала, количество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод (ведения и дозу вируса).

За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием пищи и т. п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала.

Признаки размножения вируса в организме лабораторного животного. В последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. В случае размножения вируса чувствительные к нему клетки повреждаются или гибнут (при значительном повреждении вирусом клеток нарушается функционирование части или всего органа).

Видимые изменения в состоянии и функционировании организма называют клиническими признаками болезни, а появление их после экспериментального заражения считают косвенным доказательством размножения вируса. Клинические признаки, появившиеся у лабораторных животных, зараженных с целью биопробы (обнаружения вируса), указывают на то, что в исследуемом патматериале содержался вирус. Эти признаки большей частью носят неспецифический характер (угнетение, снижение аппетита, одышка и т. п.), и на этом этапе исследований еще нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание.

Нередко заболевание заканчивается гибелью, что также бывает через определенное время после заражения и служит одним из признаков размножения вируса в организме.

На размножение вируса в организме указывают не только клинические признаки и гибель животного, но и видимые изменения самих органов и тканей, которые возникают в связи с гибелью зараженных вирусом клеток. Патологоанатомические признаки выражаются изменением цвета, размера, формы и консистенции органов, а также в появлении образований, в норме не встречающихся.

Итак, три признака указывают на наличие вируса в материале, которым заражали лабораторных животных: симптомы болезни, патологоанатомические изменения и гибель. Однако не всегда названные признаки сопровождают размножение вируса в организме. Например, вирус, содержащийся в патматериале, полученном от лошади, не может легко и с клиническими проявлениями размножаться в организме белых мышей. В первом пассаже лишь единичные вирусные частицы найдут для себя чувствительные клетки, но их будет так мало относительно целого органа, что видимых изменений организма не возникнет. Такой пассаж получил название «слепого».