26. Ртга (задержки): принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации — на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител и вируса

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях, поэтому необходимо делать разведения вируса либо сыворотки.

РТГА позволяет решать следующие задачи:

1. определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке;

2. идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам;

3. установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна.

Недостаток: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА:

• готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (по 0,25 или 0,2 мл);

• к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ (гемагглютинирующие единицы)

• смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса ньюкаслской болезни 40-60 мин при комнатной температуре);

• ко всем смесям добавляют равные объемы 1 % суспензии отмытых эритроцитов;

• после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах (рисунок 29).

Предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

На точность определения титра антител влияет и кратность разведения сыворотки. Чем она меньше, тем точнее будет определен титр антител.

27. Рнга (пассивной): принцип реакции, компоненты, контро-ли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Сущность РНГА: эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобре-

тают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител). Этот феномен положен в основу метода обнаружения и титрования антител. Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген антитело и регистрируется визуально по характеру сформированного осадка.

Следует отличать РНГА от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются в ре зультате взаимодействия их рецепторов с рецепторами вирусов (рисунок 31), а в РНГА комплексом антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены называют эритроцитарным антигенным диагностикумом или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном. Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антитела, называют эритроцитарным антительным диагностикумом или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

В качестве носителей (адсорбентов) антигенов или антител могут применяться не только эритроциты, но и частицы целлюлозы, бентонита, латекса и др. Довольно широко используют латекс вследствие его стандартности и технологичности изготовления диагностикума (проводят только стадию сенсибилизации).

Методика постановки РНГА включает:

а) приготовление сенсибилизированных эритроцитов (подготовка эритроцитов, их фиксация, танизация и сенсибилизация);

б) постановку главного опыта РНГА. Обычно в ветеринарных лабораториях ставят только главный опыт, а сенсибилизированные эритроциты готовят на предприятиях биологической промышленности.

Процесс приготовления эритроцитарного диагностикума:

• Подготовка эритроцитов. Для этой цели широко применяют эритроциты барана и человека, птиц (кур, индеек, уток); приготовленные на них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности. От соответствующего вида животного берут кровь общепринятым методом. Дефибринированную кровь трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия при центрифугировании;

• Фиксация эритроцитов. Преимущество фиксированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для фиксации эритроцитов чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Методики фиксации эритроцитов различны: 50 % взвесь отмытых эритроцитов соединяют с равным объемом 50 % формалина и после двухчасового контакта при 37 °С с периодическим встряхиванием эритроциты 3 раза отмывают 0,15 M/NaCl (рН 7,2);

• Танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты малоизучен. Однако при этом достигается главное танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью белков. Танизацию формалинизированных эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов 3

• % взвеси эритроцитов и раствора танина (1:20000). После 10-15-минутного контакта при 37 °С смесь центрифугируют, осадок трехкратно промывают фосфатным буфером (рН 7,2);

• Сенсибилизация эритроцитов. 10 % концентрацию эритроцитов на 0,15 М фосфатном буфере (рН 6,4) смешивают с равным объемом вируссодержащей жидкости. Смесь выдерживают 60 мин при 37 °С, периодически встряхивая, затем центрифугируют и 2-3 раза отмывают. Осадок сенсибилизированных эритроцитов разводят до 1 % концентрации в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), содержащем 1 % нормальной кроличьей сыворотки (для стабилизации эритроцитов).

Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РНГА.

Главный опыт РНГА . Реакцию ставят в пробирках или в лунках плексигласовых панелей (рисунок 32). РНГА ставят микрометодом, используя автоматические пипетки (1-, 8-, 12-канальные) с изменяющимися объемами (рисунок 33). Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают при 56 °С 30 мин.

Исследуемую сыворотку разводят двукратно в объеме 0,2 мл физраствором с рН 7,2-7,4, содержащим 1 % нормальной сыворотки кролика, затем к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл сенсибилизированных антигеном эритроцитов.

Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет проводят через 2-3 ч по осаждению эритроцитов в контроле.

Опыт сопровождают следующими контролями:

• на спонтанную гемагглютинацию эритроцитарного антигена (сенсибилизированные эритроциты + физраствор с 1 % кроличьей сыворотки)

• 2) на активность сенсибилизированных эритроцитов (сенсибилизированные эритроциты + положительная сыворотка);

• 3) на специфичность сенсибилизированных эритроцитов (сенсибилизированные эритроциты + нормальная сыворотка или другая негомологичная для данного антигена сыворотка);

• на отсутствие в сыворотках неспецифических гемагглютининов (исследуемые сыворотки + несенсибилизированные эритроциты).

Результаты реакции оценивают по четырехбалльной шкале:

+++ перевернутый «зонтик» с неровными краями;

++ по краю агглютинированных эритроцитов намечается тонкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов;

+ по краю агглютинированных эритроцитов располагается широкое кольцо из неагглютинированных эритроцитов;

(-) эритроциты оседают на дно в виде диска (колечка) отрицательный результат.

При положительной реакции эритроциты равномерно распределяются по дну пробирки или луночки в виде зонтика, а при отрицательной оседают в виде компактного осадка или колечка в центре луночки. Достоверные результаты получают при отсутствии гемагглютинации: испытуемой сыворотки с несенсибилизированными эритроцитами, диагностикума с заведомо отрицательной сывороткой, при положительной реакции диагностикума с заведомо положительной сывороткой.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, которое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов.

РНГА позволяет решать задачи: а) обнаруживать антитела и определять их титр в сыворотках крови. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные вирусом; б) обнаруживать и идентифицировать вирусный антиген. Для этого используют эритроциты, сенсибилизированные антителами.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность (по этому показателю она превосходит РДП, РСК и близка к иммуноферментному методу), простота техники постановки и быстрота ответа (через 2-3 ч).

Недостатки: трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты компонентов, необходимость подбора режима сенсибилизации для каждого вида вируса и т. д.)