18. Питательные среды и растворы для культивирования эукариотических клеток.

Растворы. Наиболее широко используют при работе с культурами растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистиллированной воде с добавлением различных солей и глюкозы.

Растворы Хенкса и Эрла – это сбалансированные солевые растворы, которые используют для приготовления питательных сред, т.к. они обеспечивают сохранение рН, осмотическое давление и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Их применяют при различных манипуляциях с культурами (отмывание от ростовых сред, разведение вируса и т. д.).

При культивировании клеток применяют диспергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25 %-ный на фосфатном буфере) используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла.

Раствор версена натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02 %ный на растворе Хенкса) используют для снятия клеток со стекла. Все растворы стерилизуют при соответствующих режимах.

Питательные среды различают:

Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенкса, Эрла), сыворотки крови (животных или человека), тканевого (эмбрионального) экстракта (эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Количество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует. Используют эти среды редко.

В настоящее время применяют в основном искусственные питательные среды. К ним относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, ферментативноказеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др. Наиболее широко в вирусологии используют 5 % гидролизат лактальбумина, 5 % и 2,5 % гемогидролизат.

Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют антибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.

Все питательные среды принято делить на две группы:

• ростовые обеспечивают жизнь и размножение клеток. Содержат 2-10

% сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;

• поддерживающие – обеспечивают жизнедеятельность клеток, но не их размножение. Они не содержат сыворотки крови, используются после заражения КК вирусами.

Сыворотка крови крупного рогатого скота обязательный компонент ростовых питательных сред. В ее состав входит ряд БАВ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фетуин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. Сыворотка представляет собой чрезвычайно сложную смесь мелких и крупных молекул, способных как вызывать, так и тормозить рост клеток. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, минеральные вещества, липиды и т.д. Белки сыворотки, прямо и специфически участвующие в стимуляции клеточного деления, называются факторы роста. Применяют сыворотки коров или сыворотки телят. Самая лучшая сыворотка для культур клеток сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать строгую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам.