35. Метод днк-зондов: принцип метода, получение днк-зондов, постановка реакции, цели применения, достоинства и недостатки метода.

Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты (в том числе и вирусные) в любых материалах, включая патматериал от больных животных. Он основан на способности одноцепочных молекул нуклеиновых кислот соединяться в двухцепочные, если они взаимно комплементарны.

Пуриновые основания (А и Г) способны связываться с пиримидиновыми (Т, Ц и У) водородными связями. Поэтому и соответствующие нуклеотиды могут связываться между собой парами А Т и Г Ц. Это свойство называется комплементарностью. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновые кислоты) способны связываться водородными связями в одну двухцепочную, если последовательность нуклеотидов одной точно соответствует последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовать пары А Т и Г

• Ц. Такие две молекулы ДНК называются взаимно комплементарными. Ими могут быть не только две молекулы ДНК или две молекулы РНК, но и ДНК с РНК (при этом вместо пары А Т образуется А У). Например, две молекулы ДНК, имеющие следующие последовательности нуклеотидов:

1. А А Г Ц А Т Г Г Ц Т Ц А А А Г Т

2. Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А Г Т Т Т Ц А

являются взаимно комплементарными. Если смесь таких нуклеиновых кислот подержать при 55 °С, то примерно через 2 ч образуются двухцепочные молекулы ДНК следующего состава:

А А Г Ц А Т Г Г Ц Т Ц А А А Г Т

Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А Г Т Т Т Ц А

Поскольку исходные одноцепочные молекулы могут происходить из разных источников, этот процесс удвоения молекул называется молекулярной гибридизацией. Нагрев материала, содержащего двухцепочные ДНК, до 80 °С или обработка его щелочью приводят к разделению двухцепочных молекул на одноцепочные, что называется денатурацией.

Любой вирус включает одну специфичную для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту в материале от больного животного, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двухцепочная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как-либо помеченной. Такая меченая одноцепочная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку или в виде атомов радиоактивного фосфора (Р³²), или в виде биотина, дающего изменение цвета, что позволяет обнаруживать зонд, а значит, и вирусную нуклеиновую кислоту, с которой зонд соединился в результате молекулярной гибридизации.

Методика обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом материале включает следующие этапы:

1. получение ДНК-зонда и его метка;

2. подготовка патматериала к исследованию;

3. молекулярная гибридизация и удаление одноцепочных нуклеиновых кислот;

4. обнаружение двухцепочных нуклеиновых кислот, включивших в себя зонд (по метке);

5. интерпретация результатов.

Получение ДНК-зонда сводится к тому, что из материала от больного животного выделяют вирус, на который хотят получить ДНК-зонд. ДНК этого вируса разрезают на фрагменты (с помощью рестриктаз). Методом электрофореза выделяют тот фрагмент, который неизменно обнаруживается в ДНК вирусов разного происхождения и является наиболее консервативным.

Из бактерий кишечной палочки выделяют те плазмиды, которые содержат ген фермента, разрушающего какой-либо антибиотик (например, ген пенициллиназы). Кольцевые плазмиды с помощью рестриктазы разрезают, превращая их в линейные, и к ним с помощью лигазы пришивают выделенный фрагмент вирусной ДНК. Плазмидные ДНК с вирусными вставками вводят в бактерии, которые затем клонируют в селективной среде, содержащей антибиотик, к которому бактерии стали нечувствительными. Накапливают массу бактерий и из них выделяют плазмидную ДНК (путем удаления белка). Выделенную плазмидную ДНК, содержащую вирусные вставки, метят радиоактивным фосфором (Р³²) путем никтрансляции и денатурируют путем нагрева до 80 °С. Образовавшиеся одноцепочные молекулы ДНК будут иметь фрагменты, комплементарные фрагментам одной из нитей ДНК-вируса. Это и есть ДНК-зонд (рисунок 41).

Для получения ДНК-зонда на вирусную РНК выбирают на основе анализа генетической карты вируса необходимый фрагмент РНК, выделяют его, а затем путем обратной транскрипции получают ДНК-фрагмент, который и встраивают в плазмиду. Обычно ДНК-зонд готовят на каждый вирус заранее, нарабатывают его и хранят до использования.

С помощью ДНК-зонда можно обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты в любом материале от больных животных. Для этой цели пригоден как свежий материал (ткани, смывы, кровь), так и высушенный, мороженый и даже частично разложившийся.

Из подлежащего исследованию материала выделяют ДНК, для чего его гомогенизируют, суспендируют, центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают препаратами, разрушающими белки (сначала протеиназой К, затем фенолом с хлороформом). После полного удаления белков осаждают ДНК при минус 70 °С, осадок отмывают спиртом и подвергают денатурации путем кипячения или обработки щелочью.

Полученные пробы из разных исследуемых материалов наносят на микропористую капроновую или нейлоновую мембрану (фильтр), расчерченную простым карандашом на квадраты (для каждого материала свой номер квадрата). Также наносят отрицательный и положительный контроли. Зонд наносят на стекло, которое затем накладывают на фильтр так, чтобы получился контакт зонда с исследуемым материалом, и 20 мин выдерживают при 80 °С, после чего температуру снижают до 55 °С, при которой идет гибридизация (около 2 ч). Затем фильтр отделяют от стекла, промывают, сушат и удаляют с него все несвязавшиеся одноцепочные молекулы ДНК, обрабатывая додецилсульфатом и цитратом натрия. Методом авторадиографии устанавливают, в каких квадратах выявляется радиоактивность, и визуально оценивают ее интенсивность (путем сравнения с контролями). Потемнение фотопленки, контактировавшей с определенными квадратами, свидетельствует о наличии в материалах этих квадратов искомой нуклеиновой кислоты вируса.

Учитывать результаты при использовании радиоактивной метки кроме авторадиографии можно и путем подсчета импульсов в счетчике.

Использование радиоактивной метки для зонда является довольно большим недостатком метода, и поэтому разрабатываются другие методы метки зонда, в том числе присоединение к зонду метки, изменяющей цвет субстрата

Метод молекулярных зондов перспективен, так как позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты любых вирусов, для которых получен зонд. Однако исследования этим методом технически довольно сложны и трудно выполнимы.

Кратко метод ДНК-зондов сводится к следующему:

• получение одноцепочного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНКзонда) и его метка.

• выделение из патматериала нуклеиновых кислот и их денатурация (расплетение двухцепочных молекул на одноцепочные).

• контакт образовавшихся одноцепочных молекул ДНК (или РНК) с ДНКзондом при 55 °С, приводящий к образованию двухцепочных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности.

• удаление всех негибридизированных одноцепочных молекул нуклеиновых кислот.

• обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.

Достоинства метода ДНК-зондов: высокие чувствительность и специфичность, универсальность, отсутствие стерильности и математических расчетов.

Недостатки: относительная технологическая сложность и трудность получения ДНК-зонда.