17. Способы и техника культивирования эукариотических клеток вне организма (монослойный, роллерный, суспензионный, на микроносителях), преимущества и недостатки каждого метода.

Монослойные культуры

Большинство нетрансформированных клеток млекопитающих могут расти только в виде монослоя, будучи прикрепленными к субстрату: к другим клеткам либо к стеклу (алюмоборосиликатное стекло, чаще модифицированное), пластику (полистирол, полиэтилен, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон, целлофан и другие при условии правильной обработки этих полимеров – пластиковая поверхность должна быть специально обработана, чтобы клетки могли к ней прикрепиться, причем клетки эукариот не прикрепляются к пластиковым чашкам, предназначенным для бактериальных культур) или металлу (качественная нержавеющая сталь или титан).

Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:

1)выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;

2)возможность быстрой и легкой замены питательной среды, сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;

3)обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток;

4)достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники;

5)возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.

Однако при использовании монослойных культут выявляются и недостатки:

1)сложность масштабирования;

2)отсутствие информативности визуального анализа;

3)трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры клеток;

4)необходимость значительных пространств.

Суспензионные культуры

Суспензионные культуры также можно получать путем обработки отобранной для пересева монослойной клеточной культуры 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА с последующим длительным периодом адаптации, сопровождающимся различными манипуляциями, предотвращающими возврат к монослою.

Суспензионное культивирование дает, по меньшей мере, 2−3-кратную экономию питательных сред, по сравнению с общепринятым стационарным монослойным культивированием при полном исключении дорогостоящих протеолитических ферментов и буферных растворов. Кроме того, суспензионные культуры представляются предпочтительными с точки зрения получения больших количеств биомассы.

РОЛЛЕРНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхно­сти горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. Многочисленность клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. 

микроносители

Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преиму­ществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарны­ми культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред и более высокий выход вирусного антигена (на 1—2 lg).

Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур.

Используемые в настоящее время микроносители на основе микропористого желатина или пористого боросиликатного стекла имеют емкость около 3000 клеток/микроноситель.