29. Рдп: принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.

РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП)

Принцип РДП: в слое агарового геля делают несколько лунок, в которые наливают антигены и сыворотки так, чтобы они находились соседних лунках. Из лунок антигены и сыворотки начинают диффундировать в слой геля во все стороны от каждой лунки. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс антиген + антитело, который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает (преципитирует) на месте образования в виде беловатой полосы преципитации (рисунок 21), которая хорошо заметна на фоне прозрачного геля. Если же диффундирующие друг другу навстречу антиген и сыворотка негомологичны, полосы преципитации не образуется.

Задачи:

1. обнаружение в сыворотке крови антител, гомологичных данному антигену (например, вирусу), производится при помощи схемы РДП, показанной на рисунке 22. Если в сыворотке S содержатся антитела к антигену AS, между лунками S и AS образуется полоса преципитации, отсутствующая между лунками с контрольными компонентами SN и AS;

2. обнаружение в материале антигена AS, гомологичного известным антителам сыворотки SS, производится по аналогичной схеме РДП. При наличии в исследуемом материале антигена, гомологичного антителам сыворотки SS, между А и SS должна образоваться полоса преципитации, отсутствующая между остальными лунками;

3. идентификация неизвестного вируса может быть произведена в РДП. Здесь AS неизвестный антиген; SS1...SS6 сыворотки, содержащие антитела к известным антигенам. Если полоса преципитации образовалась, например, между лунками с AS и SS3, значит, исследуемый антиген гомологичен антителам сыворотки SS3;

4. титрование антител сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным антигеном (в нашем примере 1:16), служит показателем титра антител в сыворотке SS

РДП часто используют для диагностики лейкоза крупного рогатого скота (под названием реакции иммунодиффузии РИД) и ИНАН (инфекционной анемии лошадей). В обоих случаях задача сводится к обнаружению в сыворотках крови антител к соответствующим вирусам (рисунок 26).

Реакция радиальной иммунодиффузии: иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Большое значение имеет чистота агара, лучше пользоваться очищенным агаром Дифко. Специфические антигены и сыворотки должны быть в высоких титрах, обеспечивающих образование комплекса антиген + антитело в количестве, достаточном для образования четко видимой полосы преципитации.

Постановка РДП. Обезжиренные предметные стекла укладывают горизонтально на холодную поверхность (можно на стол). Пипеткой набирают 1,5-2 мл агара, нагретого до 60 °С, и зигзагообразным движением выливают его сначала по периметру предметного стекла, а потом быстро заполняют его середину, следя за тем, чтобы не образовывались пузыри и волны. Стекла с налитым агаром (слой 1,5-2 мм), оставляют лежать 5-10 мин для затвердения агара (превращения золя в гель). В слое застывшего агара вырезают лунки. Их количество и взаимное расположение определяются целью, с которой ставят РДП, но диаметр лунок должен быть около 5 мм, а расстояние между соседними лунками 3-4 мм. Наиболее часто используют два типа расположения лунок.

Для вырезания лунок можно использовать готовый штамп (трубочки с острыми краями, жестко скрепленные в соответствии с типом расположения и количеством лунок). Если готового штампа нет, можно воспользоваться любой трубкой подходящего диаметра, например гильзой от патрона к мелкокалиберной (калибр 5,6) винтовке. В этом случае целесообразно нарисовать карандашом на бумаге количество и взаимное расположение лунок и, подложив этот трафарет под стекло с агаром, по нему вырезать лунки. Остающийся в лунках агар можно извлечь иглой, ученическим пером или пастеровской пипеткой. У образовавшихся лунок дном служит стекло, а стенками слой агара. Чтобы избежать подтекания жидкостей под агар, рекомендуют лунки заплавить, с тем, чтобы они были полностью в слое агара. Для этого пользуются разными приемами: пастеровской пипеткой в лунку вносят горячий (50-60 °С) агар и тотчас отсасывают его обратно. Соприкасаясь на короткое время с холодным дном и стенками лунки, агар успевает частично застыть и покрыть тонким слоем дно и стенки лунки. Однако если стекла хорошо обезжирены и застывший слой агара прочно сцеплен со стеклом (не «плывет» при наклоне), то и без дополнительной заливки лунок полосы преципитации образуются нормально.

В подготовленные лунки заливают компоненты РДП: антигены и сыворотки. Нужно следить, чтобы компоненты ни в коем случае не переливались через край лунок, а только заполняли объем каждой. Для этого их лучше заливать мелкими каплями с помощью тонко оттянутых пастеровских пипеток.

После заливки компонентов РДП предметные стекла помещают во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание агара. В качестве влажной камеры можно использовать любую закрывающуюся емкость (эксикатор, чашку Петри), в которую положены намоченные водой вата или фильтровальная бумага. Влажную камеру оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат (в термостате диффузия идет быстрее, но незначительно).

Предварительный учет результатов рдп производят через 8-10 часов, основной через 24 и окончательный через 48 часов.

Постановка РДП в чашках Петри по технике принципиально не отличается от постановки на предметных стеклах, только тогда слой агара наливают толщиной до 3 мм, лунки делают большего диаметра и на большем расстоянии. Но в этом случае время учета отодвигается до 5-7 дней.

Методика РДП в капиллярах не нашла широкого применения в практике. Препараты РДП на предметных стеклах можно через 48-72 ч высушить и ок-

расить раствором амидного черного. Это позволяет сохранять препарат неопределенно долго и улучшает возможности фотографировать полосы преципитации.

Достоинства РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, не требует стерильности, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми антигенами, возможность документирования результата путем фотографирования.

Но все эти достоинства существенно умаляются ее основным недостатком низкой чувствительностью. Тем не менее, РДП достаточно широко пользуются в лабораторной диагностике вирусных болезней животных.