7.Вирусоскопия как метод диагностики вирусных инфекций. Световая, электронная, иммуноэлектронная микроскопия.

Вирусоскопия метод микроскопического исследования морфологии вируса. Морфологию вирусов изучают следующими методами электронной микроскопии: ультратонких срезов, негативного контрастирования и оттенения металлами.

Метод ультратонких срезов позволяет установить строение вируса на срезе, тип его нуклеиновой кислоты, способ проникновения в клетку и выхода из неё, а также место размножения в клетке.

Метод негативного контрастирования даёт высокое разрешение и позволяет изучить форму и размеры вирионов, структурную организацию их оболочек. Для негативного контрастирования используют очищенные и концентрированные препараты вирусов. Из контрастирующих веществ чаще применяют соли фосфорно-вольфрамовой и кремнийвольфрамовой кислоты.

Метод оттенения металлами (золотом, платиной и др.), происходит испарение в вакуумё, что позволяет установить размеры и форму вирусов, используя длину полученной тени и угол, под которым велось оттенение.

Световая микроскопия – использование световых лучей. Она подразделяется на обычную, фазово-контрастную, поляризационную, люминистентную, ультрафиолетовую.

Электронная микроскопия – применяют поток электронов. Материалы предварительно контрастируют веществами, интенсивно рассеивающими электроны. Для контрастирования в процессе фиксации для липидов и белков используют четырёхокись осмия, для фосфолипидов перманганат калия, для углеводов рутений красный. В момент фиксации препарат окрашивают уранилацетатом и фосфорно-вольфрамовой кислотой.

Иммуноэлектронная микроскопия обнаруживают вирионы в исследуемом материале и специфические конгломераты вирусов и антител.

8. Устройство и принцип работы электронного микроскопа, приготовление препаратов для электронной микроскопии.

По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому, но освещение объекта обеспечивает не луч света, а поток электронов от вольфрамовой нити, нагреваемой электрическим током. Разрежающая способность современных электронных микроскопов – 0,2 – 0,4 нм, рабочее увеличение в среднем – 100000 раз. Принцип действия электронного микроскопа основан на бомбардировке объекта пучком электронов. Электронный микроскоп состоит из электронной пушки (источник электронов), электромагнитных катушек (системы линз: конденсорная, объективная и проекционная), предметного столика, экрана для изображения и окуляра. Для работы микроскопа необходим вакуумный насос, т.к. движение электронов возможно только в вакууме. Объект помещают перед объективной линзой и пучок электронов, формирующейся конденсорной линзы проходит через объективную линзу с определенным углом отклонения. Внизу находится флуоресцирующий кран, перед проекционной линзой образуется промежуточное изображение и из этой линзы пучки идут на флуоресцирующий экран, где появляется четкое изображение.

9. Тельца-включения при вирусных заболеваниях: морфология, состав, расположение в клетке, диагностическое значение.

При репродукции многих вирусов в клетках образуются внутриклеточные вирусные тельца-включения. Они могут быть цитоплазматическими и внутриядерными. По природе это или скопление многих тысяч вирионов, оставшихся в клетке, или клеточный материал, изменившийся под действием репродукции вирионов, или избыток вирусных белков, не вошедших в состав вирионов, или комбинация этих элементов (чаще всего). Размер телец-включений колеблется от едва заметных до размеров клеточного ядра, а количество от одиночных до 10-12 на одну клетку. Тельца-включения, образуемые в клетках некоторыми вирусами, получили специальные названия. Так, тельца-включения, образуемые вирусом бешенства в цитоплазме нервных клеток, называются тельцами Бабеша-Негри, образуемые в цитоплазме эпителиальных клеток вирусами оспы птиц тельцами Боллингера, а оспы млекопитающих тельцами Гварниери, вирусом чумы плотоядных тельцами Лентца, вирусом инфекционного ларинготрахеита кур тельцами Зейфреда.

Как правило, РНК-содержащие вирусы образуют цитоплазматические, а ДНК-содержащие внутриядерные тельца-включения. Небольшая группа вирусов вызывает образование телец-включений обоих типов.

Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, структура и местоположение в клетке телец-включений, образованных разными вирусами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образованы, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале.

Для некоторых вирусных болезней (бешенство) обнаружение телецвключений настолько специфично (патогномонично), что позволяет судить о виде инфекции. В большинстве же случаев обнаружение вирусных телец-включений лишь вспомогательный метод диагностики.

Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с последующей микроскопией. Проводят окраску по Муромцеву (для обнаружения, телец Бабеши-Негри). Мазки и отпечатки готовят из нефиксированного мозга. Кусочек аммонова рога растирают до гомогенной массы и делают грубые мазки на обезжиренные стекла. Мазков должно бить не менее 4, т.к. при малом количестве телец, их можно обнаружить не в каждом мазке. Фиксируют 1-2 часа помешают мазки или отпечатки в банку с жидкостью и плотно закрывают крышкой, чтобы не было испарения. Вынимают из фиксатора, промывают дистиллированной водой и погружают в раствор синька Мансона на 5-10 мин. Мазок становится синефиолетовым. Не промывая, мазок переносят в раствор танина для дифференцирования, которое продолжают до тех пор, пока мазок не приобретет голубой цвет. Промывают мазок водой, обсушивают и на несколько секунд помещают в спирт. Смотрят под иммерсией без покровного стекла. Тельца фиолетово-розового цвета с базальной зернистостью. Эритроциты красные. Ядра синие, ядрышки темносиние. Нервная ткань светло-голубая.

Окраска по Селлерсу. Применяют за рубежом. На влажный мазок или отпечаток наливают на 10 с. краску специального состава (краска + спирт), смывают проточной водой и просматривают под иммерсией (или под покровным стеклом).

Тельца красно-фиолетового цвета. Эритроциты розово-желтые. Ядра и ядрышки голубые. Клетки розовые