28. Рн: принцип реакции, компоненты, контроли, варианты постановки, учет результатов, цели применения, достоинства и недостатки.

Принцип РН: в пробирке соединяют равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса, и после выдержки определяют, сохранился ли в смеси активный вирус путем заражения смесью, чувствительной к взятому вирусу живой системы (биопроба на тест-объектах)

Отсутствие действия вируса на тест-объект (отрицательная биопроба) при положительном контроле расценивается как свидетельство нейтрализации биологической активности вируса антителами сыворотки и, следовательно, гомологичности антител сыворотки и антигенов вируса. В случае же положительной биопробы считают, что нейтрализации вируса не произошло, т.к. сыворотка не содержит антител к взятому вирусу.

Т.к. антитела с гомологичными антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях и содержание антител в сыворотке всегда неизвестно, берут ряд пробирок и делают разведения.

Постановка рН с разведениями сыворотки.

1. Готовят ряд последовательных 2-кратных разведений испытуемой сыворотки в одинаковых объемах. Количество разведений должно быть тем больше, чем выше предполагается титр антитела в сыворотке.

2. Ко всем разведениям сыворотки добавляют такие же объемы гомологичного вируса, взятого в таком титре, чтобы в каждый тест-объект при заражении попало бы ровно 100 ЭД₅₀ вируса.

3. Смеси вируса с сывороткой выдерживают определенное время при определенной температуре в зависимости от вируса.

4. Каждой смесью в одинаковых объемах заражают равные труппы чувствительных к взятому вирусу тест-объектов.

5. Учитывают результат действия вируса на тест-объекты в каждой группе (по разведениям сыворотки).

6. Рассчитывают разведение сыворотки, защищающее 50 % тест-объектов от действия 100 ЭД₅₀ вируса, используя метод Кербера или Рида и Менча.

7. Рассчитанное разведение сыворотки и принимают за показатель титра вируснейтрализующих антител в ней.

Постановка рН с разведением вируса.

1. Готовят два ряда последовательных 10-кратных разведений вируса в одинаковых объемах (количество разведений зависит от титра вируса).

2. Ко всем разведениям первого ряда добавляют в том же объеме испытуемую сыворотку (в небольшом разведении).

3. Ко всем разведениям второго ряда добавляют в том же объеме нормальную сыворотку, т.е. животного того же вида, в том же разведении и тем же методом освобожденную от неспецифических ингибиторов вирусов, что и испытуемая, но заведомо не содержащую антител к взятому вирусу.

4. Все смеси вируса с испытуемой и нормальной сыворотками выдерживают установленное время при определенной температуре в зависимости от вируса.

5. Каждой смесью в одинаковых дозах заражают равные группы тестобъектов, чувствительных к взятому вирусу.

6. Учитывают результат заражения по каждой группе тест-объектов, считая за положительный результат действие вируса, а за отрицательный отсутствие действия.

7. Рассчитывают титр вируса в присутствии исследуемой сыворотки (TAS+SS) и титр вируса в присутствии нормальной сыворотки (T_AS+SN).

8. Определяют, во сколько раз T_AS+SS ниже, чем T_AS+SN. Это число называется индексом нейтрализации (ИН). Он тем больше, чем выше концентрация антител в испытуемой сыворотке.

Считается, что если ИН меньше 10, антител к использованному вирусу в испытуемой сыворотке нет, а если ИН больше 100, антитела достоверно есть (ИН от 10 до 100 сомнительный результат).

Реакция нейтрализации позволяет решить следующие задачи:

1. определить титр вируснейтрализующих антител в сыворотке, или ИН;

2. идентифицировать неизвестный вирус путем испытания его с различными заведомо известными сыворотками;

3. установить антигенное родство между вирусами.

Достоинства РН: универсальность и высокая специфичность.

Недостатки РН: большая трудоемкость; стерильность материалов и инструментов; высокая стоимость живых тест-объектов; математические расчеты; длительность биопробы.

Следует всегда помнить, что сыворотки, идущие в РН, должны быть предварительно освобождены от термолабильных неспецифических ингибиторов вирусов путем их прогревания (в разведенном не менее чем в 2 раза виде) в течение 30 мин при температуре от 56 до 63 °С в зависимости от вида животного, от которого получена сыворотка. Так, сыворотки лошади и морской свинки требуют прогревания при 56 °С, кур при 58, крыс и кроликов – 60.