30. Метод флюорохромирования, принцип метода, приготовление препаратов, диагностическая ценность. Люминесцентная микроскопия, устройство и принцип работы люминесцентного микроскопа.

Флуорохромирование это обработка препарата флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения препарата.

Выпускаются специальные наборы флуорохромов. Наиболее широко применяется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый и др.) и тиозиловая группа (примулин). Флуорохром чаще всего используют в водных растворах очень низкой концентрации (1:1000-1:1000000). Метод флуорохромирования может быть использован при изучении некоторых вирусов (оспы, болезни Борна, аденовирусах и др.).

Наибольший интерес представляет акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию НК. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом ДНК ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а РНК рубиново-красным.

Препараты для флуорохромирования готовят двумя способами:

а) на свежий мазок-отпечаток (из органов, соскобов со слизистых оболочек) или суспензии инфицированных клеток наносят 1-2 капли рабочего раствора (1:10000) акридинового оранжевого, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким образом свежий (в течение 10-20 мин после его приготовления) препарат рассматривают в люминесцентном микроскопе;

б) мазки-отпечатки, полученные из патматериала, или инфицированные КК (на покровных стеклах) фиксируют 96 ° этиловым спиртом в течение 15-30 мин, промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридинового оранжевого (1:10000), через 5-10 мин накрывают покровным стеклом и исследуют.

В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изумрудно-зеленое свечение, РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветом. В препаратах ДНК-содержащих вирусов (аденовирусов), вирусный материал светится зеленым цветом в ядре в виде гранул различной величины. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса (грипп), вирусный материал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток.

Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное), применяют обработку препаратов 0,5 % раствором РНК-азы или ДНК-азы в течение 5-10 мин или облучение УФ-лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные продолжают светиться еще 20-30 мин. Это служит доказательством специфичности вирусных НК.

Метод простого флуорохромирования несложен, но он не дает возможности полно дифференцировать возбудителей болезней.

В люминесцентном микроскопе используют систему светофильтров для выделения сине-фиолетовой части спектра (ФС-1, СС-4 + СС-8), теплозащитные фильтры для предохранения оптики от перегревания и выцветания препаратов (СЗС-14, СЗС-7, БС-8, кювет с водой или раствором медного купороса) и запирающий фильтр на окуляре для снятия возбуждающего света и пропускания света люминесценции (ЖС-18, ЖС-3). Люминесцентный микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создаст помехи, что особенно сказывается при микрофотографировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вредные газы от источника света. Лампа достигает полной силы света через 5-10 мин после включения, если сила тока при работе равна 4-5 А. Повторное включение лампы возможно только после ее охлаждения.

Большинство исследователей проводят люминесцентную микроскопию препаратов в падающем свете, поскольку он имеет ряд преимуществ перед освещением препарата снизу: наименьшая потеря света, идущего от источника света, лучший спектральный состав возбуждающего света, незначительное попадание прямого света в глаза исследователя и увеличение освещенности объектов.

При люминесцентной микроскопии используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло высокого качества. Иногда применяют его заменитель диметилфталат, длительное использование которого может привести к порче объективов.