22. Получение первично-трипсинизированной культуры клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить из любого органа или ткани человека или животного.

Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1-4 мм) и обрабатывают ферментами (трипсином), разрушающими межклеточные вещества. Полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при его полном покрытии в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку монослой.

Обычно монослой формируется через 3-5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7-21 дня (в зависимости от вида клеток и состава пита тельной среды). Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10).

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. Получают из первичных клеток, выращенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, растущая в новой питательной среде и пересева на новые матрасы или пробирки. Через 2-3 суток формируется монослой.

Субкультуры получают от 2-5 пассажей (перевивок) и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на стадии перехода к перевиваемым культурам клеток.

23. Титр вируса, единицы измерения, титрование вируса в инфекционных единицах локальных повреждений.

Количество вируса в материале определяют по титру вируса в этом материале, т.е. выражение его концентрации в материале. Титр вируса это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Т.к. количество вируса нельзя выразить в обычных (объем, масса) единицах, его измеряют в ЕД или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие.

Три типа единиц количества вируса:

• инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту;

• инфекционные единицы 50 % действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически;

гемагглютинирующие единицы

Из локальных повреждений выделяют бляшки в зараженных культурах клеток (измеряют в бляшкообразующих единицах БОЕ) и оспины (некротические узелки) на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами (оспообразующих единицах ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной оспины.

Определение титра вируса в БОЕ или ООЕ. Точно отмеренными и строго одинаковыми объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриные эмбрионы на ХАО. Затем подсчитывают, сколько образовалось в каждом матрасе бляшек или в каждом эмбрионе оспин, и рассчитывают среднее арифметическое этого количества. Оно точно равно количеству БОЕ или ООЕ вируса, содержащегося в заражающей дозе вируссодержащего материала. Т.к. объем заражающей дозы точно известен, нетрудно рассчитать, сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вирус содержащего материала. Это и будет титром вируса в материале. Рассчитать титр вируса (Т) можно по формуле т= н/ва

где n среднее арифметическое количество бляшек на один матрас или оспин на один куриный эмбрион; V объем заражающей дозы; а разведение вируссо-

держащего материала, взятое для заражения.