5.3. Жидкостная хроматография
Жидкостная хроматография (ЖХ) - метод разделения и анализа сложных смесей, в котором подвижной фазой является жидкость. Метод ЖХ характеризуется более широким кругом анализируемых объектов, чем газовая хроматография, поскольку большинство веществ не обладает достаточной летучестью, многие неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переведении в газообразное состояние. В методе ЖХ разделение проводят, как правило, при комнатной температуре. Особенности различных вариантов ЖХ обусловлены физико-химическими свойствами жидкой подвижной фазы.
Большой выбор элюентов позволяет в широком диапазоне варьировать параметры удерживания и селективность хромато- графической системы. Некоторые жидкостные хроматографы предусматривают применение градиентного элюирования. Селективность в методе ЖХ (в отличие от газовой хроматографии) определяется не одним, а двумя факторами - природой подвижной (элюент) и неподвижной (адсорбент или жидкость) фаз.
В классическом варианте ЖХ выполняется в стеклянной колонке длиной 1-2 м, заполненной сорбентом (размер частиц > 100 мкм). Микрошприцем вводят в хроматограф анализируемую пробу, которая перемещается в колонку непрерывным потоком элюента. Скорость прохождения элюента под действием силы тяжести мала, продолжительность анализа значительна. Тем не менее, такой вариант ЖХ до настоящего времени достаточно широко применяется в лабораторной практике, поскольку не требует дорогостоящего оборудования.
Применение сорбентов с размерами зерен 10 - 30 мкм, поверхностно- и объемно-пористых сорбентов с размерами частиц 5-10 мкм, нагнетательных насосов и высокочувствительных детекторов обусловило переход от классической к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Наиболее интенсивное развитие ЖХ в научном и прикладном плане получила в последние 25 лет, с того момента как стал разрабатываться высокоэффективный вариант ЖХ, получивший название высокоэффективная жидкостная хроматография. Применение сорбентов с размером частиц 3 - 10 мкм позволило резко увеличить эффективность хроматографического разделения. Однако для элюирования подвижной фазы через высокоэффективные колонки нужны насосы с большим рабочим давлением 1-20 МПа, способные точно поддерживать заданный расход элюента. Это существенным образом усложняет требования к конструкции жидкостного хроматографа.
Широкое применение ВЭЖХ в аналитической практике привело к дальнейшему развитию хроматографических методов анализа. Быстрый массоперенос при высокой эффективности разделения позволяет использовать ВЭЖХ для разделения и определения веществ, содержащих нейтральные молекулы (адсорбционная и распределительная хроматография), разделения и определения ионов (ион-парная хроматография), разделения по фракциям высокомолекулярных соединений (эксклюзионная хроматография). Методами аффинной и лигандообменной хроматографии разделяют биологически активные вещества и оптические изомеры.
В адсорбционном варианте ЖХ в зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. В НФХ используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в ОФХ - неполярный адсорбент и неполярные подвижные фазы. В обоих вариантах принципиальное значение имеет выбор подвижной фазы. Неподвижная фаза удерживает разделяемые вещества, подвижная фаза (растворитель или смесь растворителей) обеспечивает различную емкость колонки и эффективное разделение компонентов смеси.
Большое внимание уделяется выбору подвижной фазы (элюенту), поскольку она оказывает решающее влияние на селективность разделения компонентов, эффективность колонки и продолжительность анализа. Подвижная фаза должна растворять анализируемую пробу, характеризоваться малой вязкостью, компоненты пробы не должны разрушаться в ходе анализа. Растворители, входящие в состав подвижной фазы, должны быть инертными к материалам всех узлов хроматографа, безопасными для человека, применимыми для данного детектора и доступными.
Элюирующая эффективность подвижной фазы определяется полярностью растворителя. В нормально-фазовой хроматографии с увеличением полярности растворителя его элюирующая эффективность возрастает, в обращенно-фазовом варианте - снижается.
Для решения практических задач применяют не индивидуальные растворители, а их смеси. Незначительные добавки второго растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую эффективность подвижной фазы.
Для идентификации компонентов анализируемой смеси необходимо точное фиксирование параметров удерживания веществ, выходящих из колонки; как правило, для этого измеряют объем или время удерживания.
В зависимости от способа элюирования различают изократические и градиентные жидкостные хроматографы. Устройство изократического хроматографа представлено на рис. 5.2. ПФ из емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с потоком ПФ поступает в элемент разделения (4) – через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных – интегратор или компьютер).
Рис. 5.2. Схема изократического хроматографа
В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться: с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы; или производиться управляющей программой с компьютера.
Для градиентного элюирования используют два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава ПФ. Первый тип – системы с формированием состава ПФ на линии низкого давления (рис. 5.3). ПФ из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3), туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль, либо управляющая программа компьютера.
Системы такого типа формируют бинарный, тернарный или кватернарный градиент. Форма функции градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Пройдя через in-line фильтр (8), образец с потоком ПФ поступает в колонку (4), а затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7).
При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор (6). В настоящее время – это компьютер, оснащенный программой для сбора и обработки хроматографических данных.
Рис. 5.3. Первый тип градиентного хроматографа
Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), они обладают рядом недостатков, среди которых основным является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов ПФ еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем – систем с формированием градиента состава ПФ на линии высокого давления. Принципиальным отличием этих систем является смешивание компонентов непосредственно в линии высокого давления. При данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания ПФ. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.
Схема градиентной системы ВЭЖХ с формированием состава ПФ на линии высокого давления представлена на рис. 5.4. ПФ из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3), туда же вводится проба. Работой насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос «master pump» или контроллер), либо управляющая программа компьютера. Системы такого типа формируют бинарный или тернарный градиент. Через in-line фильтр (8) образец с потоком ПФ поступает в разделительную колонку (4), затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор (6).
Рис. 5.4. Второй тип градиентного хроматографа
Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства – термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, предколонки) и т.д.
Таким образом, радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам ПФ и сорбентов, отсутствующих в классической колоночной и планарной жидкостной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей. Большое значение приобретает пробоподготовка, в итоге которой должен получиться истинный раствор смеси аналитов, с достаточной концентрацией, необходимой для детектирования. Требуется, чтобы этот раствор был совместим с другими элементами хроматографической системы, невыполнение этого требования может привести к критическим условиям работы прибора. Для сорбентов важнейшими требованиями являются химическая инертность по отношению к аналиту и ПФ, прочность и способность стабильно эксплуатироваться при высоких давлениях. Зернение и размер пор сорбента, его тип должны соответствовать техническим характеристикам хроматографа.