Прямая днк-диагностика

Условием проведения прямой ДНК-диагностики является точное знание структуры и расположения гена.

Методически подходы к прямой ДНК-диагностике сводятся либо к поиску известных мутаций (ПЦР и ее модификации, блот-гибридизация), или к выявлению неизвестных мутаций (мутационный скрининг гена, секвенирование гена, параллельный молекулярно-генетический анализ).

Большинство вышеуказанных методик используют единый метод анализа структуры фрагментов ДНК, осуществляющийся с помощью различных способов электрофореза ДНК в агарозном или полиакриламидном геле. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК способны перемещаться в электрическом поле, создаваемом в геле. При этом скорость продвижения молекул определяется их величиной: чем меньше фрагменты ДНК, тем быстрее они продвигаются в геле и наоборот. После проведения электрофореза результат идентифицируется путем сравнения скорости прохождения мутантных и нормальных аллелей, которые отличаются по длине.

Косвенная днк-диагностика

Косвенную ДНК-диагностику возможно проводить, когда структура гена неизвестна, но ген заболевания картирован. Теоретической основой косвенной ДНК-диагностики является положение, что гены в хромосоме расположены линейно и наследуются сцепленно. То есть ген и прилежащий к нему участок ДНК после кроссинговера остаются в составе одного сегмента хромосомы и передаются потомству как единое целое. Этот участок ДНК, представляющий собой последовательность из нескольких нуклеотидов, называется маркер. Этот маркер существует в виде нескольких вариантов (аллелей), которые сильно различаются у разных лиц даже в пределах одной семьи. Поэтому наследование этого маркера можно проследить в ряду поколений в этой семье, сделать вывод о наследовании сцепленного с этим маркером патологического гена и выявить, является ли пробанд носителем хромосомы с исследуемым маркером и, соответственно, с патологическим геном.

Оптимальным подходом к проведению ДНК-диагностики является последовательное сочетание различных методик (прямых и косвенных).

Сравнительная характеристика прямых и косвенных методов ДНК-диагностики

Признак	Прямая ДНК-диагностика	Косвенная ДНК-диагностика
Предмет анализа	Мутация в гене заболевания	Полиморфные маркеры
Необходимость знания структуры гена	Да	Нет
Точность	100%	90-95%
При полилокусном заболевании	возможна	невозможна
Наличие пробанда	необязательно	обязательно

76. Геномные мутации. Мозаицизм. Механизмы возникновения.

Геномные мутации - это мутации, которые приводят к добавлению либо утрате одной, нескольких или полного гаплоидного набора хромосом.

Геномные мутации, как и хромосомные, являются причинами возникновения хромосомных болезней.

К геномным мутациям относятся анеуплоидии и изменения плоидности структурно неизмененных хромосом. Геномные мутации выявляются цитогенетическими методами.

Анеуплоидия – изменение числа отдельных хромосом в наборе либо в сторону уменьшения (гипоплоидия) – моносомия, либо в сторону увеличения (гиперплоидия) – трисомия, полисомия) в диплоидном наборе, некратное гаплоидному (2n+1, 2n-1 и т.д.).

Полиплоидия – увеличение числа наборов хромосом, кратное гаплоидному (3n, 4n, 5n и т.д.).

Механизмы:

• Нарушения нормального расхождения хромосом в мейозе (анафаза I- и анафаза-II)

• Кроссинговер

• Случайное слияние гамет

Пример: Синдром Клайнфельтера, Синдром Дауна,  синдром Шерешевского — Тёрнера, синдром Эдвардса и др.

Хромосомный мозаицизм – явление одновременного наличия в организме нескольких клеточных клонов с разным кариотипом. Может возникнуть на любой стадии эмбрионального развития либо в результате митотического не расхождения хромосом, либо вследствие утраты хромосомы вследствие анафазного отставания.

Может возникать в результате:

• перераспределения (кроссинговер) в соматических клетках,

• соматических мутаций в зиготе или на ранних стадиях дробления;

• неправильного расхождения (сегрегации) хромосом при делении клеточного ядра (митозе).

• генотерапии

Для диагностики мозаицизма исследуют кариотип крови или клеток ткани — требуется большее число клеток, чем при диагностике полных форм, так как часть клеток будут демонстрировать обычный кариотип.

Это следует учитывать при пренатальной диагностике генетических аномалий плода, например, при таких анализах плода как биопсия хориона (можно проводить на ранних сроках беременности).