Плазмиды и их функции

·        F-плазмиды – донорские функции

·        R-плазмиды – устойчивость к лекарственным препаратам, гены синтеза ферментов, разрушающих препарат.

·        Col-плазмиды – синтез колицинов,пестицины,вибриоцины,стафилоцины-бактерицидные вещ.

·        Ent-плазмиды – синтез энтеротоксинов

·        Hly-плазмиды – синтез гемолизинов у кишечной палки.

·  Биодегративные плазмиды – разрушение различных органических и неорганических соединений, в т.ч. содержащих тяжелые металлы.

·плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов  патогенности, способствующих развитию инфекционного процесса в макроорганизме.

·Регуляторные =компенсирование дефектов метаболизма посредством встраивания в повреждённый геном.

Мигрирующие генетические элементы - участки ДНК, способные осуществлять собственный перенос (транспозицию) внутри генома. Кодируют транспозазу.

-Вставочные (инсерционные) последовательности — IS-элементы — участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, между репликонами. Содержат тоолько гены для перемещенияй + ген для синтеза репрессора=регулирует процесс перемещения. На концах – инвертированные повторы=узнаются транспоназой, которая творит одноцепочечные разрывы ДНК по обе стороны. По итогу одна цепь элемента на прежнем месте, вторая перемещается.

ФФ - регуляция акт. генов, индукция мутаций типа делеций или инверсий (при перемещении) и дупликаций, координация взаимодействий плазмид, траспозонов и профа-гов.

-Транспозоны — сегменты ДНК, те же свойства IS, но есть структурные гены синтеза молекул специфического биологического свойства (токсичностью, или устойчивость к антибиотикам).

Перемещение подвижных элементов=репликативная\незаконная рекомбинация и вызывает:

• инактивацию генов участков ДНК, куда они встраиваются;

• образование повреждений генетического материала;

• слияние репликонов, встраивание плазмиды в хромосому;

• распространение генов в популяции, изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний.

Интегроны - система захвата малых элементов ДНК= генные кассеты, посредством сайтспецифической рекомбинации и их экспрессии.

Интегрон = консервативный участок на 5' конце, содержит ген, кодирующий интегразу, сайт рекомбинации att и промотор Р.

Интегроны могут располагаться на хромосоме и плазмидах= возможно перемещение кассет в пределах одной клетки и по популяции.

Острова патогенности. В геноме патогенных -  участки ДНК не менее 10 000 пар, отличаются составом Г–Ц-пар нуклеотидных оснований. ФФ: синтез факторов-островов патогенности= развитие патологического процесса. Большинство на хромосоме (Salmonella), но могут в составе плазмид (Shigella) и фаговых ДНК (V. cholerae 0 1 , 0139).

Трансдукция - перенос бактериофагом фрагментов генетического материала клетки, исходно содержавшей бактериофаг. В процессе репликации бактериофага фрагмент ДНК бактерии проникаеь в фаговую частицу и переносится в другую бактерию при инфицировании.

Типы трансдукции:

-неспецифическая (общая)=фагом может быть перенесён любой фрагмент ДНК хозяина

-специфическая=строго определённые фрагменты при условии, что эти гены локализованы в непосредственной близости от мест интеграции профага

-абортивная=внесённый фрагмент ДНК донора не встраивается в генофор реципиента, а остаётся в цитоплазме.

Свойства трансдуцирующих фаговых частиц следующие.

• несут часть ДНК фага, не являются функциональными вирусами.

• не способны к репликации.

Сексдукция – процесс переноса генетического материала между бактериальными клетками F´-плазмидами с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции.

Трансформация – перенос генетического материала, бактерия- реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК.

Зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния донорской трансформирующей ДНК.

Компетентность — способность бактерии поглощать ДНК белками клеточной мембраны с специфическим аффинитетом к ДНК. В клетку-реципиент проникает одна нить ДНК, другая — на клеточной мембране — подвергается деградации с высвобождением энергии для проникновения первой нити.

Стадии:

1) адсорбция двухцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток;

2) ферментативное расщепление связавшейся ДНК в некоторых местах с образованием фрагментов 4- 5х106 дальтон;

3) проникновение фрагментов, сопровождающееся разрушением одной из цепей. Проникшая цепь ДНК рекомбинирует с генетическим материалом реципиентной клетки.

Применение при картировании бактериальных генов.

Трансфекция – вариант трансформации  клеток, лишенных клеточной стенки, вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой.

Природа и свойства бактериофага, классификация по химическому строению, по морфологическим признакам.

Бактериофаги - группа вирусов, паразитирующих в бактериях. Формы жизни: покоящаяся внеклеточная и вегетативная внутри-.

Литические бактериофаги = вирусы, вызывающие гибель бактерий.

По спектру действия:

-типовые (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида,

-моновалентные, лизирующие одного вида

-поливалентные, лизирующие нескольких видов.

Типы взаимодействия с бактерией: продуктивный, абортивный и интегративный.

Морфологические типы: нитевидные, мелкие кубические без отростка или с рудиментом, сперматозоидной формы, с кубической головкой и хвостовым отростком с сокращающимся или нет чехлом. Размеры 20-800нм.

Сперматозоидные фаги=колифаги Т

Головка икосаэдрического типа из однотипных субъединиц =капсомеры из белковых молекул аспарагиновой и глутаминовой кислот, лизина.

Геном = спирально упакованная двойная нить ДНК внутри головки и защищена капсидом. Иногда есть гисоноподобный белок для суперспирализации ДНК.

Хвост включает полый стержень (по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. В дистальном отделе стержня - шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами).

Продуктивная инфекция:

-Адсорбция = прикрепление к бактерии при помощи поверхностных структур бактериальной стенки=рецепторы для фагов. Иногда используются в качестве рецепторов пили. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L-формы) не адсорбируются.

-Инъекция фага =ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом из базальной пластинки дистальной части отростка. Одновременно в чехле высвобождаются Са2+, акт. АТФазу= сокращение чехла и вталкивание стержня в клетку. Внедрение вирусной ДНК в цитоплазму.

-Репродукция фага=перестройка метаболизма, ДНК бактериофага транскрибируется транскриптазой, иРНК в рибосомы хозяина=синтез «ранних»фаговых белков.

-Синтез фаговых белков. В первую очередь ферменты, необходимые для обр. копий ДНК= ДНК-полимераза, киназы и тимидилат синтетаза. Вирусная РНК-полимераза транскрипция «поздних» для сборки фаговых частиц дочернего поколения.

-Сборка зрелых фаговых частиц Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка взаимодействует с хвостом. Хвост с фибриллами.

-Выход дочерних популяций и лизис клетки. Могут колучать капсиды в процессе прохождения через ЦПМ.

«Негативные колонии бактериофага» в культурах, засеянных сплошным «газоном» на твёрдых средах=обр. зон просветления - «стерильных пятен». В микробиологической диагностике возбудителей инфекционных болезней= фагоди-агностика.

Антигенные свойства=сод.группоспецифические и типоспецифические антигены, иммуногенные свойства. По этим свойствам делятся на серологические группы.

Вирулентный фаг, умереный, профаг, лизогенизация.

Вирулентные вызывают продуктивную инфекцию и приводят к лизису. Существуют в вегетативном (размножение в клетках бактерий) или в зрелом (метаболически инертное вне бактерий) состоянии.

Дефектные фаги=неспособны образовывать зрелые фаговые частицы ни в естественных условиях, ни при индукции профага

Умеренные— факторы изменчивости бактерий. Кроме вегетативного и инертного состояния есть состояние профага (интегрированное с хромосомой).

Лизогения=совместное сосуществование бактерии и умеренного бактериофага

Лизогенные бактерии= несут профаг. Не продуцируют фаговых частиц, т.к. в бактерии синтезируется репрессор, но могут при индукции профага.Резистентны к гомологичным суперинфицирующим фагам. Белковый репрессор вирусной ДНК «выключает» вирулентные фф фага. Переход на литический цикл(индукция) при нарушениях синтеза репрессора + воздействие факторов

Фаговая конверсия=изменение свойств микробов под влиянием профага. Фенотипически= изменение типа колоний, антигенных свойств.

Применение бактериофагов для типирования и индикации бактерий, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Для установления источника инфекции, путей передачи возбудителя, выявления определенных видов бактерий.

Фагодиагностика сибирской язвы, брюшного тифа, можно определить типы (варианты) внутри одного вида.

Размножение фагов в культурах на плотных средах = зоны просветления (стерильных пятен, бляшек или негативных колоний) определенных размеров и формы.

Размножение в жидких культурах = просветление среды.

Методы выявления специфического действия фагов=фагоидентификация, фаготипирование:

1. Метод Отто (стекающей капли) для идентификации неизвестных бактерий с помощью диагностических фагов. На чашку с МПА наносится капля суточной бульонной культуры и шпателем распределяется по агару. Капле суспензии известного бактериофага наклоном чашки дают стечь по поверхности агара. При соответствии фага и бактерий = отсутствие роста.

2. Метод Фишера. Каплю испытуемой бульонной культуры на МПА и шпателем распределяют. Чашку делят на квадраты, в центре – поливалентный фаг. В секторах –фаги с различной специфичностью. В центре лизис точно будет, а в каком секторе лизис – тот тип бактерии.

3. Метод Фюрта. В расплавленный и остуженный МПА добавляют суспензию бактериофага. Смесь разливают в чашки, каждую делят на несколько секторов, высевают культуры.

Индикация бактерий = реакция нарастания титра фага. При наличии гомологичных бактерий фаг размножается, нарастает титр (количество) при диагностике дизентерии и брюшного тифа.

Фагопрофилактика – это предупреждение бактериальных инфекций путем применения бактериофаговтпри дизентерии и брюшном тифе.

Фаготерапия –способ лечения бактериальных инфекций (брюшного тифа, дизентерии, холеры) специфическими бактериофагами.

Трансдуцирующие фаги широко используются в генной инженерии для картирования генома бактерий.

Выделение бактериофагов из субстратов, контаминированных бактериями, из лизогенных бактерий. В качестве субстрата - отделяемое гнойных ран, испражнения, сточные воды, старые бактериальные культуры. Для индукции профага воздействуют факторами. Индуцированный профаг вызывает лизис. Суспензию субстратов (лизат культуры) фильтруют через мелкопористые фильтры или центрифугируют. Фильтрат исследуют на способность лизировать бактерии.

Спот-теса (капельного теста) на поверхность агара в чашке высевают культуру, на нее каплю суспензии бактериофага

Метод агаровых слоев по Грациа В чашку наливают слой МПА. После застывания наливают 2 мл расплавленного и охлажденного полужидкого (0,7%) агара, в который добавляют каплю бактериальной суспензии и суспензии фага. Бактерии размножаются внутри верхнего слоя =сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны негативные колонии фага. Позволяет рассчитывать концентрацию (титр) фага в исходной суспензии.

Титрование по методу Аппельмана. Готовят серию десятикратных разведений фильтрата бактериофага и вносят в свежезасеянный бульон. Максимальное разведение фильтрата, вызывающее полный лизис бульонной культуры =титр бактериофага.

Получение фаговой суспензии с высоким титром путем инфицирования концентрированной жидкой бактериальной культуры или путем высева смеси фага и бактерий на питательный агар. В последующем фаги освобождают от остатков питательной среды и бактериальных клеток центрифугированием или фильтрованием через бумажные фильтры. Получаемая при этом суспензия фага может содержать до 1011 -1012 фаговых частиц в 1 мл. Большие количества фага получают путем добавления в аппараты с бульонными культурами бактерий суспензии специального производственного фага, выдерживают при температуре 37°С одни сутки, затем фильтруют. Полученный фильтрат проверяют на чистоту, стерильность, безвредность и активность.

Репарация ДНК, основные направления:

1. Непосредственная реверсия от повреждённой ДНК с помощью ферментативной реакции(метилтрансферазы; фотолиазы).

2. «Вырезание» повреждений с восстановлением исходной структуры (эксцизи-онная репарация).

3. Активация особых механизмов для выживания при повреждениях ДНК (восстановление исходной структуры ДНК в результате рекомбинации; коррекция ошибочного спаривания оснований; трансляционный синтез на повреждённой матрице ДНК). Эти механизмы не всегда приводят к полному восстановлению исходной структуры ДНК.

4.Система фотореактивации в присутствии света расщепление тиминовых димеров,превращая в мономеры.

5.Система темновой репарации:

-дорепликативная: обнаружение и надрезание поврежденного фрагмента ДНК-эндонуклеазой→удаление вырезанного фрагмента ДНК-полимеразой I→синтез нуклеотидов по матрице второй сохранившейся нити либо ДНК-полимеразой I, либо ДНК-полимеразой III→«сшивание» восстановительного фрагмента ДНК с основной нитью, осуществляемое лигазой

-пострепликативная: дефекты ДНК застраиваются фрагментами неповрежденных нуклеотидов

Учение об инфекционном процессе. Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Фракасторо впервые применил в медицинском смысле термин «инфекция». Описал оспу, корь, чуму, чахотку, бешенство, проказу, сыпной тиф и другие.

Труды Фракасторо заложили первые основы клиники инфекционных болезней и эпидемиологии.

Пастер объяснил, что инфекционные болезни имеют микробиологическую природу и возникают в результате попадания в организм болезнетворных микроорганизмов. Л. Пастер предложил метод борьбы с инфекционными заболеваниями при помощи прививок, для которых применяются культуры микроорганизмов с ослабленным болезнетворным действием (вакцины).

Боткин 1860-1861 гг. организовал первую клинико-экспериментальную лабораторию, где проводились первые в России исследования по клинической фармакологии и экспериментальной терапии. описал клиническую картину инфекционного гепатита («болезнь Боткина»)

Мечников- создатель учения о фагоцитозе и теории иммунитета, сформулировал общую теорию воспаления как защитную реакцию организма и создал новое направление в иммунологии - учение об антигенной специфичности.

Возбудители инфекции= прионы, вирусы, бактерии, грибы, простейшие, гельминты (их проникновение – инвазия).

Понятия

Инфекция —совокупность физиологических и патологических процессов взаимодействия макроорганизма и микроорганизма при определенных условиях среды. Не обязательно болезнь.

Инфекционный процесс – взаимодействия макроорганизма и микроорганизма при определенных условиях внешней среды

Инфекционная болезнь –частный случай процесса у конкретного индивидуума, крайняя форма инфекционного процесса с определенным симптомокомплексом.

Характерно:

1) наличие патогенного микроорганизма как причины;

2) контагиозность (заразность); наличие заразительного периода, когда возбудитель распространяется от больного к восприимчивому.

3) наличие инкубационного периода и характерная смена периодов болезни

4) развитие характерных клинических симптомов; специфичность

5) наличие иммунного ответа;

6) возможность развития микробного носительства.

7)нозологическая специфичность

8)формирование иммунитета

По длительности: острый и  хронический

По выраженности: манифестный (ярко выраженный), бессимптомный (слабо выраженный), абортивный (неполный набор симптомов), латентный (скрытый).

Может протекать в форме:

1. Латентной (скрытой) бессимптомной. Патогенный агент персистирует в организме долгое время без выраженных симтомов. Например: возбудитель туберкулеза, вирус герпеса в афф. ганглиях тройничного, возбудитель бруцеллеза в мезентериальных лимфатических узлах. Возбудитель не выделяется во внешнюю среду, инфекция переходит в манифестную форму при снижении иммунитета.

2. Бактерионосительства (вирусоносительства) после перенесенной латентной или ифекционного заболевания. Поддерживается резистентностью микроорганизма, могут выделять во внешнюю среду.

3. Инфекционной болезни–крайнее проявление инфекционного процесса, клинически выраженная инфекция. Нарушение жизнедеятельности, функциональные расстройства, морфологические повреждения, выделение во внешнюю среду.

В зависимости от возбудителя:  бактериальные, микозы, вирусные