Реакция агглютинации

-простая, два компонента: АГ и АТ.

Сущность = связывание полных двухвалентных АТ+ корпускулярные АГ на пов. частиц при нличии электролитов= склеивание в неспецифической фазе взаимодействия.

Для идентификации выделенных микроорганизмов:

1) Ориентировочная РА по типу Грубера на предметном стекле:к капле диагностической сыворотки брюшнотифозную, паратифозные А- и В- в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида+ культуру возбудителя=через несколько мин. обр. хлопьевидный осадок= +реакция. Для предварительного диагноза.

2)Развернутая РА по типу Грубера. Ставят с одной сывороткой, реагировавшей предварительно в ориентировочной.

Разведениями агглютинирующей сыворотки= определяют титр сыворотки – макс. разведение, дающее агглютинацию – и сравнивают с диагностическим титром.

Для определения АТ в сыворотке больного: разведения сыворотки крови больного + диагностикум(взвесь убитых микробов), инкубируют. Отмечают наибольшее разведение сыворотки(титр), при котором вышла агглютинация. Агглютинация с О-диагностикумом(бактерии убиты нагреванием) медленнее и мелкозернистая агглютинация, с Н-диагностикумом(убитые формалином) – быстрее и крупнохлопчатую.

Реакция +, если агглютинация в разведении, близком к титру диагностической сыворотки.

РА для определения АТ у больных брюшным тифом (реакция Видаля), бруцеллезом (реакция Райта), туляремией и для определения групп крови.

Для более достоверных результатов - типоспецифические сыворотки= макс. удалены групповые АГ

Получение типоспецифич.сывороток=Реакция Кастеллани

Специфисность АГ пов. в направлении: «группа →вид→тип». Групповые агглютинируют родственные виды с родственным АГ. Устранение групповой агглютинации=удаление АТ к групповым АГ путем смешивания сыворотки с микробами, дающими групповую агглютинацию, потом центрифугирование.

3)Реакция Кумбса для определения антирезусных АТ для диагностики патологий лизиса эритроцитов, резус-конфликта.

Антирезусные АТ+Резус положит. эритроциты+антиглобулиновая сыворотка кролика против иммуноглобулинов чела=агглютинация

4)Реакция Видаля для  серодиагностики брюшного тифа и паратифов А и В, определения АТ, и изучения динамики нарастания и сохранения антител против S.typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B в крови больного со 2-ой недели заболевания.

Компоненты: исследуемая сыворотка в разведениях от 1:100 до 1:800; три диагностикума - взвеси убитых сальмонелл: S.typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi В; 0,85% раствор NaCl (физиологический раствор).

Реакция ставится в три ряда пробирок по 5 пробирок в каждом ряду.  

Реакцию инкубируют:

1) в термостате в течение 2 часов при 37°С, при этом образуются крупнохлопчатый осадок за счет жгутикового Н-антигена;

2) при комнатной температуре в течение 18-24 часов, выпадает мелкозернистый осадок за счет соматического О-АГ.

Механизм реакции. Реакция протекает в две фазы:

1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза);

2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглютината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).Соединение =образованию макроконгломератов.

Диагностический титр 1:200, то есть реакция считается положительной при наличии агглютинации в разведении сыворотки 1:200 и более (рис.28).

Реакция пассивной (непрямой) агглютинации (РПГА или РНГА) и реакция обратной пассивной (непрямой) агглютинации (РОПГА или РОНГА)

простые, компоненты: АГ искусственно адсорбирован на пов. сенсибилизированных эритроцитов и АТ в сыворотке исследемой.

Назначение = поиск АТ. Высокочувствительна и высокоспецифична для диагностики инфекционных болезней, установления беременности, выявления повышенной чувствительности к лекарствам.

АТ+ эритроциты= обр. «решетки». Реакция в лунках, добавляют несколько разведений сыворотки в физрастворе и диагностикум. Инкубация и оценка:

+ = эритроциты оседают на дно лунки равномерно покрывают его в виде перевернутого «зонтика» с неровными краями.

- = эритроциты оседают, покрывают дно в виде «пуговки» (диска) с ровными краями.

РОНГА = используется антительный эритроцитарный диагностикум= эритроциты с сорбированными АТ. Назначение– поиск АГ.

Механизм такой же, только «узлы» решетки =АГ. Для поиска в крови токсинов – дифтерийного или ботулинического , обнаружения АГ в материале при высокой концентрации.

Реакция латексагглютинации = диагностические АТ или АГ сорбируются на частицах латекса. Большая скорость = учитывать через 10-15 минут, высокая чувствит. и специфичность. Для экспресс-диагностики АГ стрептококков, стафилококков, гемофильной палочки, менингококков в тканевых жидкостях, в мазках из зева.

Реакция коагглютинации основана на способности белка А золотистого стафилококка связывать Fc-фрагменты иммуноглобулинов. Высокая скорость за минуты.

На предметное стекло наносят взвесь сенсибилизированных известным АТ стафилококков и добавляют взвесь исследуемых микробов или материала с высокой конц. АГ. Механизм как у РОНГА, носители АТ =стафилококки. Результат:хлопья из стафилококков,АТ диагностической сыворотки и определяемого микроба.

Реакция торможения гемагглютинации(РТГА)=блокирование АГ вирусов АТ иммунной сыворотки=вырусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

Эритроциты животного+антивирустные АТ+вирус=нейтрализация вирусов

Для диагностики вирусных болезней.

Реакции иммунитета: гемолиза, РСК=Реакция связывания комплемента , преципитации. Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

 

Реакция иммунопреципитации (преципитации, РП)

Простая. Высокочувствительна и высокоспецифична. Быстрота в течение секунд.

Суть: мелкодисперсные растворимые АГ (гаптены, преципитиногены) +АТ (преципитины)=переход в нерастворимую фазу, обр. видимого осадка (преципитата) или помутнения среды.

Для выявления АГ по известной иммунной преципитирующей сыворотке с АТ -преципитины. В процессе титрования разводят АГ. Реакционная среда должна содержать электролит (физраствор) и нейтральный pH.

Применение:

-микробиология: диагностикаэпидемич.цереброспинальный менингит, сибирская язва,туляремия, чума, оспа, аденовирусы.

-судебная:определение видовой пренадлежности белка крови(из пятен обр.вытяжку, наслаивают на преципитирующие сыворотки с АТ к белкам крови)

-санитария: фальсификация продуктов, устанавливают, из какого мяса\рыбы\муки изготовлены.

Способы:

В жидкой среде:

I) Реакция кольцепреципитации в специальных узких пробирках, вносят иммунную сыворотку, сверху наслаивают не допуская перемешивания раствор АГ. Учет через 1-2 мин.На границе двух растворов = кольцо преципитации молочного цвета. Для выявления АТ к бруцеллам в молоке.

Модификация – реакция термопреципитации по Асколи при сибири= искомые АГ перед реакцией экстрагируют из различного материала кипячением15 мин и фильтрованием.Ставят контроли: преципитирующая сибириязвенная сыворотка+стандартный специфич.преципитоген\физиологич.раствор, нормальная лошадиная сыворотка+исследуемый термоэкстракт.

Качественные реакции, нельзя установить кол-во АГ.

II) Реакция флоккуляции по Рамону в пробирках со смешиванием растворов АТ и избытка АГ =обр. хлопьевидный осадок или помутнение. Для определения акт. анатоксина или антитоксина.

III) Реакция микропреципитации для выявления низких титров АТ. Растворы АТ и АГ смешивают, измеряют изменения оптической плотности(повышается).

В геле:

I) Двойная иммунодиффузия(по Оухтерлони) – в полужидком геле агара, он застывает, вырезаются лунки(одна в центре, 4-5 по окружности), помещают раздельно АГ и иммунную сыворотку(в центральную лунку). Диффундируют в гель и при их гомологичности обр. комплексы= линии преципитации между лунками. Когда производится поиск АГ в различных жидкостях,для сравнения АГ или сывороток=по характеру линий можно судить об идентичности АГ:

1) АГ полностью идентичны – линия единая, дугообразная;

2) совершенно не совпадают – линии пересекаются крест-накрест;

3) отличаются, но имеют общие эпитопы – линия дугообразная, со стороны АГ с несовпадающим эпитопом отходит «шпора».

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Тест-АГ и разведения растворов, исследуемых на наличие АГ, в лунки в пластине геля с моноспецифической антисыворотки с известным содержанием АТ. АГ диффундирует в гель, обр. кольца преципитации, диаметры зав. от конц. АГ в лунках. Построение калибровочной кривой= зависимость диаметров преципитантов от конц. АГ.

Для изучения токсигенности и отбора клонов с высокой степенью токсичности: культуры засевают в чашки с агаром с антитоксической сыворотой. Вокруг колоний обр. кольца преципитации, диаметр пропорционален степени токсичности.

II) Иммуноэлектрофорез = иммунодиффузия + электрофорез.

Внесение смеси АГ в лунку геля, разделяют электрофорезом: разные АГ распределяются между катодом и анодом с разной скоростью по всей длине пластинки геля. Сыворотку вносят в канавку по краю пластинки параллельно движу белков. АГ и АТ движутся навстречу благодаря постоянному электрическому полю (до нескольких часов). Обр.дугообр.линии преципитации.

Реакции иммунного лизиса: гемолиза и бактериолиза.

Сложные (требуют комплемента и состоят из простых реакций).

Реакция бактериолиза для диагностики холеры. Исследуемую сыворотку каплями наносят на питательную среду, которая засеяна культурой холерного вибриона. При положительной реакции в местах нанесения капель благодаря действию антител и комплемента образуются стерильные пятна. Сыворотка с комплементом и искомыми антителами также используется в реакции иммобилизации трепонем (потеря подвижности у живых трепонем) и реакции агглютинации-лизиса лептоспир (образование конгломератов набухших, фрагментированных и полностью лизированных лептоспир).

Реакция связывания комплемента=реакция гемолиза

К иммунному комплексу АГ-АТ через Fcфрагмент АТ может присоединяться комплемент. В отсутствие АГ-АТ комплемент свободен и активен.

Фазы:

1)Специфическая: искомый АГ (или АТ в сыворотке) + с диагностич. сыворотка (или диагностикум) +система комплемента= если гомологичны – обр. комплексы(нельзя зарегистрировать).

2)Индикаторная: вносят гемолитическую систему – эритроциты барана и гемолитическую сыворотку с АТ к эритроцитам.

Если комплексы не обр.=НЕТ АТ= (отрицательный результат), комплемент свободен и связывается с гемолитической системой(с АТ на эритроцитах) = гемолиз, появление «лаковой крови».

Если образовались (положительный результат) комплемент будет связан и нет гемолиза – эритроциты в осадок, жидкость прозрачна.

 В 5-и пробирках. Исследуемую сыворотку (I) прогревают 56°С 30 минут для инактивации комплемента и пипеткой вносят по 0,5 мл в первую и пятую пробирки. Второй пипеткой 0,5 мл заведомо позитивной сыворотки (II) во вторую(контроль).

Третьей 0,5 мл заведомо негативной сыворотки (III) в 3-ю (контроль). Четвертой по 0,5 мл физиологического раствора (IV) в четвёртую и пятую пробирки (контроль). Этой же по 0,5 мл специфического АГ (V) в первую, вторую, третью, четвёртую пробирки. Пятой пипеткой по 0,5 мл комплемента во все пробирки.

Отдельно готовят гемолитическую систему (VII) - смесь равных объемов 3% суспензии эритроцитов барана и гемолитической кроличьей сыворотки. Гемолитическую сыворотку добавлять к суспензии эритроцитов. Выдерживают 30 минут в термостате 37°С и шестой пипеткой вносят по 1,0 мл в пробирки 1,2,3,4,5.

После в термостат 37°С до полного гемолиза в контрольных пробирках.

Результат оценивают по четырёхплюсовой системе. Для определения титра специфических АТ исследуемую сыворотку (I) последовательно двукратно разводят физиологическим раствором.

Титр= наибольшее ее разведение, давшее задержку гемолиза.

Реакция радиального гемолиза (РРГ) в лунках геля из агара с эритр.барана и комплементом. Вносят гемолитич.сыворутку в рез.радиальной диффузии АТ обр.зона гемолиза.

Реакции твёрдофазного иммунологического анализ=на первом этапе всегда известный (стандартизированный) компонент реакции (АГ\АТ) заранее в производственных условиях фиксируется в лунках планшета.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) = применение АТ, меченных флюорохромом для выявления АГ.

Варианты:

-прямая РИФ-выявление АГ(урогенитальные,холера, чума, сибирь). Мазки и мазки-отпечаки тканей на стекле. Добавление меченых АТ в сыворотке к искомому АГ с последующей отмывкой. Помещают в УФ-микроскоп и творят анализ:свечение=есть возбудитель.

-непрямая-обнаружение АТ: готовых тест-мазок с АГ+сыворотка крови больного, отмывка, добавить антиглобулиновую сыворотку с меченными АТ. В УФ-микроскопе. Интенсивность свечения зависит от количества образовавшихся иммунных комплексов, а, следовательно, от количества АТ в сыворотке больного.

Применение: экспрессдиагностика инфекционных заболеваний, поиск АГ в любом биологическом материале, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, ЗППП.

Радиоиммунный анализ (РИА) =добавление к сорбированному на твердой фазе АГ сыворотки и меченных радиоактивным изотопом диагностических АТ. Конкурентная методика:

Если в сыворотке есть АТ к АГ - будут конкурировать с диагностическими АТ и снижать вероятность связывания= измеренная радиоактивность тем ниже, чем выше титр АТ в сыворотке.

Нет АТ - радиоактивность макс. (все АГ связываются с радиоактивными диагностическими изотопами).

Для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, определении опухолевых маркеров и конц. Ig.

Реакция нейтрализации:

Двухкомпонентная сложная.

Основана на способности АТ связывать возбудители или экзотоксины и метаболиты.

Для определения типа ботулинового экзотоксина.

Виды: нейтрализации вирусов (РНВ) и нейтрализации токсинов (РНТ).

РНВ =сыворотка переболевших лиц с АТ (выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой и введением животному).

РНТ (реакция флоккуляции) = иммунная сыворотка с АТ (антитоксины) связывает токсин и блокирует его действие.

Флоккуляция – помутнение в экспериментальной пробирке со смесью токсина и антитоксина.

Для определения антитоксического иммунитета у человека - кожные пробы (например, пробу Шика).

Для идентификации токсина и определения титра антитоксических АТ - вводят животным. При соответствии типа токсина и антисыворотки гибели нет.

Компоненты реакции: диагностические противоботулинические антитоксические сыворотки A, B, E, F; исследуемый материал от больного с предполагаемым ботулиновыв экзотоксином. Индикаторная система - мышей.

Постановка: в 5 пробирок исследуемый материал, в четыре добавляют - антитоксические сыворотки. 5-я пробирка – «контроль» –материал и физиологический раствор. Оставляют на 30 минут.

5 мышам вводят по 1,0 мл смеси внутрибрюшинно. Учёт в течение 4-х суток (ежедневно).

Есть экзотоксин = мышь погибает обязательно. Выживает только одна с нейтральной смесью т.к. тип экзотоксина совпал с типом сыворотки и произошла нейтрализация.

Реакция торможения гемаглютинации(РТГА)

Реакция иммобилизации

Иммуноферментный анализ (ИФА)=выявление АГ с помощью АТ, коньюгированных с ферментом-меткой(пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). В смесь добавляют субстрат-расщепляется ферментом, изменяется цвет. Интенсивность окраски=кол-во связавшихся АТ\АГ. Прерывают добавлением кислоты. Количество расщепленного субстрата будет пропорционально количеству связавшейся меченной антиглобулиновой сыворотки, т.е. количеству искомого объекта.

В лунки планшета адсорбируют известный АГ. Исследуемая сыворотка (хАТ) вносится в лунку планшета. При наличии в сыворотке соответствующих АГ АТ, образуется комплекс АГ+АТ, прочно связанного с планшетом. Производят отмывку буферным раствором. Затем в лунку вносят антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. Антитела антиглобулиновой сыворотки, меченной ферментов, взаимодействуют с искомыми АТ, образуется комплекс АГ+АТ+АТ меченные. Чтобы выявить этот комплекс, к нему добавляют субстрат для фермента и индикатор. Если результат положительный, то цвет индикатора изменится.

Твердофазный=АГ или АТ сорбирован на твердом носителе в лунках планеток или полистирола.

1)Опрелеляют АТ в сыворотке в лунках с сорбированным АГ+иммуноглобулин человека меченный+субстрат+в процессе промывать для удаления лишнего=меняется цвет.

2)Опрелеляют АГ в сыворотке в лунках с сорбированными диагностич. АТ +АТ,меченные,против диагностич.сыворотки+субстрат + в процессе промывать для удаления лишнего=меняется цвет.

Конкурентный ИФА: АГ и меченный ферментом АГ конкурирют за связывание небольшого кол-ва АТ. Можно наоборот с АТ.

Для диагностики в малых конц.

Аллергия. Аллергологический метод диагностики.

 

Аллергия(термин от Пирке) – тип иммунного ответа, специфическая пов. неадекватная реакция иммунитета на повторное поступление АГ в сенсибилизированный организм = развитие воспаления, повреждение, дисфункция.

 

Аллерген = АГ, способный вызвать аллергическую реакцию у чувствительного организма. Обычно белок с ферментативной акт. и небольшой молекулярной массой.

- эндогенные (аутоаллергенные): первичные (естественные), приобретенные ( вторичные) неинфекционные(ожоговые, лучевые, холодовые) и инфекционные (комплексные, промежуточные)

-экзогенные инфекционные (микроорганизмов) и нет (бытовые, пищевые, пыльцевые, эпидермальные, химич., паразитарные, инсектные)