Методы изучения фагоцитоза

Прямой =микробы смешиваются с фагоцитами в пробирке или в животном, через 15 и 120 мин. -микропрепараты и окрашиваются по Романовскому-Гимзе. Микроскопически подсчитывается число фагоцитирующих клеток и фагоцитированных микробов. Расчет показателей:

• фагоцитарный показатель = кол-во фагоцитирующих фагоцитов: кол-во всех фагоцитов (N = 40-60%);

• фагоцитарное число (ФЧ) = кол-во фагоцитированных микробов : кол-во фагоцитрующих фагоцитов (N = 4-7);

• показатель завершенности фагоцитоза

Непрямой=изучается функциональная акт. фагоцитов на различных стадиях фагоцитоза: определение хемотаксической акт., определение адгезивных свойств, переваривающей способности.

Механизм презентации:

1) поглощение АГ АПК и заключение его в везикулу;

2) ферментативное расщепление (процессинг) АГ;

3) связывание АГ пептидов с ГКГС II;

4.1) транспортировка комплекса на пов. мембр., распознавание наивными Т-хелперами (CD4 + -лимф.)=комплекс иммунных реакций.

4.2) Презентация АГ, которые находятся в цитозоле в комплексе с ГКГС I. Распознаются Т-киллерами (CD8 + -лимфоцитами)= лизис только одной клетки

Гуморальные факторы неспецифич. Иммунитета:

Липидные медиаторы (эйкозаноиды) - продукты арахидоновой кислоты= простагландины, лейкотриены, тромбоксаны.

Антимикробные пептиды: дефенсины(нейтрофильные и эпителиальные, моноцитами, лимфоцитами, индуцибельно кератиноцитами,моноцитами, дендритными, тучными)

Кателицидины-противомикробный, ак. хемотаксиса и дегрануляции тучных.

Цитокины

Продуценты= моноциты/макрофаги и Т-лимфоциты (CD4).

Свойства: плейотропизм, полифункциональность, «цитокиновая сеть»= взаимосвязь, акт. в низких конц., перекрываемость.

-интерфероны –гамма= противовирусная и иммуномодуляция(лифц., фибробласты, НК),противоопухолевая и иммуномодулирующая

-интерлейкины (ИЛ1-ИЛ18)– опосредуют межлейкоцитарные взаимодействия; Продуцируют: ДК, макрофаги, НК, Т-В-лимф.

-хемокины

-ФНО (фактор некроза опухоли)

-ФТР (трансформирующие ростовые факторы) – регуляция воспаления и ангиогенеза;

-CSF (колониестимулирующий фактор)

Классификация по биологической акт.:

1. регуляторы воспалительных реакций: провосп. (ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-18), противо. (ТРФβ, ИЛ-10, ИЛ-4)

2. регуляторы клеточного ответа (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-10, ИФНγ, ТРФβ).

3. регуляторы гуморального ответа (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ- 10, ИЛ13, ИФНγ, ТРФβ).

Белки острой фазы(реактанты воспаления)

Секретируются гепатоцитами при тяжелых острых воспалительных процессах и в ответ на повреждение:

-положительные (продукция при воспалении усиливается). Пентраксины(С-реактивный белок, сывороточный амилоид А, пентраксин 3).

- отрицательные (снижается).

ФФ: растворимые PRR, запускают комплемент, уч. в опсонизации микроорганизмов, акт. нейтрофилы, моноциты/макрофаги, регулируют синтез цитокинов.

Комплемент

– комплекс сывороточных белков, опосредующих воспалительные реакции при участии гранулоцитов и макрофагов.

Синтезируются гепатоцитами, макрофагами и инейтрофилами.

ФФ: бактериолиз, цитолиз, стимул фагоцитоза, участие в аллергических реакциях немедленного типа, индукция синтеза медиаторов воспалительного ответа(ИЛ-1), реакции свертывания крови, способствуют межклеточным взаимодействиям для АПК.

Из 9 белковых компонентов (фракций) – от С1 до С9. На три блока:

I блок – распознающий (С1 с подфракциями);

II блок – активирующий (С2 – С4);

III блок – мембраноатакующий (С5 – С9).

Для субкомпонентов и продуктов расщепления добавляют строчные латинские (dq, C3b). Активированные компоненты - чертой над литерой, инактивированные - буквой «i» (iC3b). 4 фактора: B, D, H, P; регуляторные белки: С1-ингибитор, С3b-активатор.

В норме неакт. Появление микробов\продуктов → акт. комплемента по типу каскадной протеолитической реакции.

Пути всегда заканчиваются обр. мембраноатакующего комплекса.

Классический путь комплексами АгАТ

1)Инициатор активации = иммунный комплекс «антиген + антитело Ig M и G»+ субкомпонент С1q и присоединение C1r, C1s=комплекс С1 q r s.

2)протеолиз С4 до а и б фрагментов. С4б + С2= расщепление С2 на а и б. С2а+С4б=С3-конвертаза. Протеолиз С3 в а и б =акт. компонент С5-конвертаза(С4б2ф3б-протеаза)

3) С5 прикрепляется к мембране клетки-мишени=обр. литического комплекса (С5Ь, С6, С7, С8 и С9)= мембраноповреждающий (мембраноатакующий) комплекс

4)Мембраноатакующий блок обр. в мембране мишени поры= выход содержимого и гибели.

Лектиновый путь запускается пов. полисахаридами бактерий и грибов с маннозой:

1)Манноза распознается маннозосвязывающим лектином и ассоциированной с ним сериновая протеаза.

2) белок акт. С4-С2 фракции комплемента.

3) совпадает с классическим.

Альтернативный путь акт. полисахаридами микробных клеток=без антитела и С1, С4 и С2. Факторы пути= сывороточные белки: В, D и пропердин (Р).

- связывание C3 с полисахаридом клеточной стенки = распад;

- C3b взаимодействует с D= расщепление B (на Ba и Bb);

- C3b с Bb = C3bBb= С3-конвертаза;

- связывание с P (пропердин) стабилизирует С3-конвертазу;

- С3-конвертаза расщепляет еще С3, усиливая;

- С3-конвертаза (C3bBb) может присоединять С3b= C3bBbС3b= С5-конвертазой;

▪ краткая запись: С3+ЛПС→C3 ⇒ C3b+D→B ⇒ Bb+C3b+P→C3 ⇒ … ⇒ C3b’Bb’С3b.

Общие завершающие этапы:

С5-конвертаза расщепляет С5 на С5a и С5b. C5b связывает С6- С9= мембраноатакующий комплекс (С5bC6C7C8C9). С9 – белок-перфорин= пора.

Эффекты: усиление фагоцитоза; индукция острого воспаления (дегрануляция тучных клеток и базофилов):анафилотоксины: С5а, C3a, C4a; 21 ; участие в аллергических реакциях (за счет гранул тучных); цитолитическое (за счет С9); удаление иммунных комплексов антиген-антитело из организма; регуляция иммунного ответа (взаимодействия лимфоцитов с рецепторами).

На ранних этапах инфекции, когда нет комплексов Аг+Ат-лектиновым и альтернативным путём. По мере накопления антител - классический.

Регуляторные механизмы по происхождению (ферменты плазмы [1], неферментные белки плазмы [2] и белки мембран [3]), и по точкам приложения:

I. Регуляция начальных этапов акт.:

• С1-ингибитор [2] – инактивирует C1r, C1s (КП) и ассоциированные протеазы (ЛП);

• С4-связывающий белок [2] – присоединяет = С4 и связывает C4b из C4bC2a;

• фактор I [1] – инактивирует С3-конвертазы и С5-конвертазы;

• фактор Н [2] – кофактор фактора I;

• инактиватор анафилотоксинов [1] – разрушение C3a, C4a, C5a.

II. Защита клеток на начальных этапах:

• DAF [3] – препятствует образованию С3-конвертаз;

• MCP [3] – усиливает активность фактора I;

• CR1 (рецептор комплемента 1 типа на эритроцитах) – действие DAF + MCP.

III. Защита клеток на поздних этапах:

• S-белок [2] – связывает комплекс C5bC6C7;

• С8-связывающий белок [3] – ингибирует присоединение С8;

• CD59 [3] – ингибирует присоединение С9.

Дефекты (дефициты) компонентов системы комплемента: С1, С2, С4=АЗ, С3 – резкое снижение сопротивляемости. С5-С9 – тяжелое, генерализованное течение многих инфекций

Дефекты (дефициты) ингибиторов: С1-ингибитор –наследственный ангионевротический отек, DAF – внутрисосудистый гемолиз эритроцитов(пароксизмальная ночная гемоглобинурия)

Система интерферонов= фактор неспецифической резистентности.

ФФ: антивирусная, противоопухолевая, иммуномодулирующая и радиопротективная.

ИФН:

-а-ИФН синтезируют лейкоциты периферической крови

-р-ИФН синтезируют фибробласты;

-у-ИФН - стимулированные Т-лимфоциты, NK-клетки и макрофагов.

По способу образования:

-ИФН типа I (в ответ на обработку клеток вирусами, молекулами двухцепочечной РНК, полинуклеотидами)

-ИФН типа II (лимфоцитами и макрофагами, акт. индукторами; как цитокин).

ИФН видоспецифичны, не обладают вирусспецифичностью. Механизм антивирусного действия: индуцируют «антивирусное состояние» клетки (резистентность к проникновению или блокада репродукции вирусов).

Блокада репродуктивных процессов при проникновении вируса = угнетение трансляции. Взаимодействует с интактными неинфицированными клетками, препятствуя реализации репродуктивного цикла вирусов за счёт активации клеточных протеинкиназ.

ИФН I= подавление синтеза вирусных белков, отпочковывание дочерних популяций. Не влияют на ранние этапы репликативного цикла (адсорбцию, пенетрацию и «раздевание» вирусов) - противовирусное действие проявляется при заражении клеток инфекционными РНК. Не проникают в клетки, взаимодействуют с рецепторами (ганглиозиды или олигосахара).

ИФН II (рИФН) =акт. ИФН NO-синтетазы = пов. внутриклеточного оксида азота=ингиб. размножение вирусов. Акт. эффекторные NK-клеток, Т-лимфоцитов, моноцитов, тканевых макрофагов и гранулоцитов= антителозависимая и независимая цитотоксичность. Блокирует депротеинизацию («раздевание») вирусов, высвобождение зрелых частиц, нарушает метилирование вирусной РНК.

Приобретённые (индуцированные) факторы защиты проникновением инфекционного агента, обладающего признаками чужеродности (злокачественная клетка, трансплантат и др.)=специфич.реакции иммунной ист.

Главный комплекс гистосовместимости – MHC=гликопротеины, относятся к суперсемейству иммуноглобулинов:

Молекулы I и II классов: трансмембранные гликопротеины, контролируют иммунный ответ, распознаются поверхностными дифференцировочными CD-Аг клеток-мишеней =реакции клеточной цитотоксичности T-лимф.

• АГ I класса = тканевые Аг; Аг класса MHC I на пов. всех ядросодержащих клеток.

• Гены II класса контролируют ответ к тимусзависимым Аг; Аг класса II экспрессируются на мембранах иммунокомпетентных клеток, макрофаги, моноциты, В-лимф. и активированные Т-клетки.

Молекулы III класса: свободные белки (комплемента С2, С4, белки теплового шока, факторы некроза опухоли)- не участвуют в распознавании АГ.