Теоретическое и экспериментальное исследование гранулоцитов

Мы предложили шар с одинаковыми сферическими гранулами в качестве морфологической модели гранулоцита и провели обширное моделирование светорассеяния этой моделью с помощью МДД. Сперва мы рассмотрели интенсивности полного и деполяризованного бокового рассеяния (ISS и I ), которые были ранее предложены в литературе для разделения нейтрофилов и эозинофилов. Общий вид зависимостей ISS и I от диаметра гранул dg одинаковый для разных значений остальных параметров модели. Степень деполяризации DSS ведёт себя ступенчато – она почти постоянна при малых dg, потом резко увеличивается в узком диапазоне dg и при бóльших dg снова почти постоянна. Более того вычисленная DSS численно согласуются с литературными экспериментальными данными для нейтрофилов и эозинофилов.

Аналитические выражения, полученные в рамках приближений Релея-Дебая- Ганса (РДГ) и второго борновского, качественно описывают все эти результаты. Более того, эти выражения численно согласуются со строгим МДД моделированием при малых dg и объёмных долях гранул. Помимо предельной простоты вычисления приближённые теории дают дополнительное понимание феномена светорассеяния и могут быть использованы для создания приближённых методов обращения.

Мы измерили индикатрисы нейтрофилов трёх здоровых доноров с помощью сканирующего проточного цитометра (СПЦ). Величины индикатрис из разных проб отличаются вплоть до пяти раз, что можно объяснить только различием во внутренней структуре нейтрофилов. Мы добавили ядро, состоящее из четырёх эллипсоидов, в нашу модель и провели дополнительное моделирование с помощью МДД. Вычисленные индикатрисы моделей с ядром и без в целом согласуются с экспериментом, однако подгонка одиночных экспериментальных индикатрис модельными пока не представляется возможным из-за большого количества параметров задачи. Было измерено распределение по диаметрам нейтрофилов с помощью спектрального метода, средние значения составляли от 9 до 10 мкм с различием менее 10% между пробами. Хотя этот метод перспективен для определения диаметра зернистых клеток, требуется его дальнейшая проверка и сравнение с другими методами, например, микроскопией

Сравнение моделей с разными диаметрами гранул dg показывает, что интенсивность рассеяния I(θ ) для каждого угла рассеяния θ определяется, в основном, определённым dg. Другими словами, наблюдается качественное соответствие между dg

и θ – бóльшие dg соответствуют меньшим θ. Решение обратной задачи светорассеяния требует точных экспериментальных данных. Дальнейшая экспериментальная работа

198

должна включать повторное измерение одних и тех же проб для оценки экспериментальных погрешностей, измерение индикатрис эозинофилов и базофилов для подхода к задаче классификации гранулоцитов и измерение поляризационной индикатрисы в качестве дополнительной информации для методов обращения.

Обратная задача светорассеяния для гранулоцитов намного сложнее чем для эритроцитов из-за сложной внутренней структуры. Результаты МДД моделирования позволяют приблизиться к этой задаче, однако на данный момент не представляется возможным строго характеризовать отдельные гранулоциты. Следовательно требуется упростить задачу: во-первых, использовать упрощённую модель формы, например, шар с несколькими популяциями гранул и ядром, адекватность которой следует проверять сравнением с точной трёхмерной моделью, полученной, например, с помощью конфокальной микроскопии. Во-вторых, можно использовать приближённые теории светорассеяния, например РДГ, для характеризации отдельных нейтрофилов или для определения средних по пробе морфологических параметров путём анализа усреднённых индикатрис.

Параметры гранулоцитов, определённые этими (приближёнными) методами, такие как зернистость или средний размер долей ядра, будут иметь немедленное клиническое применение. В этом случае сканирующий проточный цитометр сможет заменить трудоёмкие наблюдения под микроскопом, который используются на данный момент для определения этих свойств гранулоцитов.

Основные результаты

1.Проведён строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и показано, что ошибки ограничены суммой линейных и квадратичных по размеру диполя членов. Предложена методика экстраполяции для улучшения точности, и методика оценки её погрешности, надёжность которой доказана эмпирически. Предложен способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации.

2.Развита компьютерная программа ADDA на основе метода дискретных диполей для моделирования светорассеяния произвольными частицами, которая применима для рассеивателей много больше длины волны, в частности, практически для всех биологических клеток в жидкости. Также ADDA превосходит аналогичные программы в вычислительной эффективности. Проведено систематическое сравнение метода дискретных диполей с методом конечных разностей во временной области, которое показало, что первый более чем на порядок быстрее при моделирования светорассеяния биологическими клетками.

199

3.Предложены четырёхпараметрическая модель формы эритроцита и метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с базой данных из 40 000 теоретических индикатрис. Проведена проверка последнего на одной пробе крови в сравнении с двумя эталонными методами определения объёма и концентрации гемоглобина. Используя базу данных теоретических индикатрис, уточнён и проверен спектральный метод определения диаметра эритроцитов.

4.Предложена упрощённая модель гранулоцита в виде зернистого шара и проведено моделирование светорассеяния этой моделью при различных параметрах с помощью метода дискретных диполей. Показано, что наблюдаемое различие в интенсивности деполяризационного бокового рассеяния между двумя подтипами гранулоцитов может быть объяснено разным размером их гранул. Эта же задача светорассеяния рассмотрена в рамках приближения Релея-Дебая-Ганса и его второго порядка – полученные аналитические выражения качественно описывают результаты численного моделирования.

5.Измерены индикатрисы нейтрофилов трёх здоровых доноров с помощью сканирующего проточного цитометра. Вычисленные индикатрисы модели зернистого шара с сегментированным ядром в целом согласуются с экспериментальными данными. Рассмотрена зависимость модельных индикатрис от размера гранул, и показаны возможные подходы к решению обратной задачи светорассеяния для гранулоцитов.

Основные результаты работы докладывались на

1.VIII-ой международной конференции «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Салобрена, Испания, 16-20 мая 2005 г.);

2.Международной конференции «Оптика биологических частиц» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г.);

3.IX-ой международной конференции «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Санкт-Петербург, 5-9 июня 2006 г.);

4.Международном семинаре по методу дискретных диполей (Бремен, Германия, 23

марта 2007 г.);

5.Международной конференции «Применение лазеров в науках о жизни 2007» (Москва, 11-14 июня 2007 г.);

6.X-ой международной конференции «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Бодрум, Турция, 17-22 июня 2007 г.);

200

7.VIII-ом международном симпозиуме «Оптическая характеризация частиц» (Граз, Австрия, 9-13 июля 2007 г.);

8.Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 2004-2007 гг.) и Университете Амстердама (Амстердам, Голландия, 2005-2007 гг.);

и опубликованы в следующих работах:

1.Yurkin M.A., Semyanov K.A., Tarasov P.A., Chernyshev A.V., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Experimental and theoretical study of light scattering by individual mature red blood cells with scanning flow cytometry and discrete dipole approximation. // Appl. Opt. – 2005. – V.44. – P.5249-5256.

2.Yurkin M.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Convergence of the discrete dipole approximation. I. Theoretical analysis. // J. Opt. Soc. Am. A – 2006. – V.23. – P.25782591.

3.Yurkin M.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Convergence of the discrete dipole approximation. II. An extrapolation technique to increase the accuracy. // J. Opt. Soc. Am. A – 2006. – V.23. – P.2592-2601.

4.Tarasov P.A., Yurkin M.A., Avrorov P.A., Semyanov K.A., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Optics of erythrocytes. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. – London: Springer , 2006 – P.231-246.

5.Semyanov K.A., Zharinov A.E., Tarasov P.A., Yurkin M.A., Skribunov I.G., van Bockstaele D.R., Maltsev V.P. Optics of leucocytes. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. – London: Springer, 2006 – P.253-264.

6.Penttila A., Zubko E., Lumme K., Muinonen K., Yurkin M.A., Draine B.T., Rahola J., Hoekstra A.G., Shkuratov Y. Comparison between discrete dipole implementations and exact techniques. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. – 2007. – V.106. – P.417-436.

7.Yurkin M.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. The discrete dipole approximation for simulation of light scattering by particles much larger than the wavelength. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. – 2007. – V.106. – P.546-557.

8.Yurkin M.A., Hoekstra A.G. The discrete dipole approximation: an overview and recent developments. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. – 2007. – V.106 . – P.558-589.

201