независимо, то средняя разница была бы пропорциональна Nsim−1 6 , при этом СМО уменьшался бы примерно в 2.1 раза при увеличении Nsim с 500 до 40 000. Это имеет место быть для HbC, что и следовало ожидать, так как он независим от всех остальных параметров. Другие четыре морфологических параметра зависимы через неравенства (181) и (182), поэтому их ошибки могут уменьшаться быстрее чем для HbC. И действительно, ошибки h и, особенно, D уменьшаются существенно быстрее, как и производные параметры: V, S и ИС. А ошибки b и c ведут себя примерно так же, как и для HbC. Средний χ2 должен быть пропорционален квадрату ошибок параметров, т.е.
, что подтверждается данными в таблице 14.
Индикатриса имеют разную чувствительность, измеряемую χ2 отклонением, к
изменению разных параметров, а χ2 метод приводит к относительно бóльшим ошибкам параметров с низкой чувствительностью чем – с высокой. Определим относительный СМО как СМО, делённый на среднее значение параметра по всей базе данных. Расположим параметры в убывающем порядке по относительному СМО, что соответствует возрастающему порядку чувствительности индикатрисы к ним: b (24%), c (4.3%), V (4.2%), HbC (3.9%), h (3.2%), ИС (3%), S (2.6%), D (1%). В скобках приведены относительные СМО для самой большой базы данных (Nsim = 40 000). Видно, что нельзя точно определить b по индикатрисе, поскольку последняя только слабо зависит от b (что и понятно, исходя из его геометрического значения). Теоретически точность можно улучшить увеличением Nsim, но это затрудняется экспериментальными ошибками, которые обсуждаются в подразделе 3.3.4. Теоретическая точность определения остальных параметров удовлетворительная, особенно учитывая, что обычно интерес представляют не отдельные значения а распределение всей пробы по этим параметрам. В частности, параметр c определяется с точностью только немного худшей чем h, в отличие от микроскопических измерений (см. подраздел 3.3.1).
3.3.4. Результаты и обсуждение
Чтобы проиллюстрировать эффективность χ2 метода, мы приводим три экспериментальные индикатрисы на рис. 44 вместе с ближайшими теоретическими
индикатрисами |
и соответствующими χ2 расстояниями. |
Параметры теоретических |
||||
индикатрис следующие: |
(1) |
D = 8.59 мкм, |
h = 2.20 мкм, |
b = 1.08 мкм, |
c = 5.72 мкм, |
|
HbC = 37.6 г/дл, |
β = 87.3°; |
(2) |
D = 7.36 мкм, |
h = 2.39 мкм, |
b = 1.99 мкм, |
c = 5.12 мкм, |
HbC = 31.4 г/дл, |
β = 88.2°; |
(3) |
D = 7.12 мкм, |
h = 2.99 мкм, |
b = 0.70 мкм, |
c = 4.20 мкм, |
158
Таблица 15. Результаты χ2 метода и сравнение с другими методами.a |
|
||||||||
Параметр |
|
СПЦ |
|
|
Coulter MAX M |
||||
эритроцита |
χ2 метод |
|
Сферизация |
|
|
|
|||
D, мкм |
7.42 |
± 1.48 |
|
|
|
|
|
|
|
h, мкм |
2.61 |
± 0.68 |
|
|
|
|
|
|
|
b, мкм |
1.03 |
± 1.15 |
|
|
|
|
|
|
|
c, мкм |
4.74 |
± 1.42 |
|
|
|
|
31.0b |
|
|
HbC, г/дл |
33.5 ± 7.5 |
|
33.4 ± 4.2 |
|
|
||||
V, мкм3 |
91 |
± 35 |
|
94 ± 26 |
|
93 ± 22 |
|
||
S, мкм2 |
118 ± 36 |
|
|
|
|
|
|
||
ИС |
0.712 |
± 0.131 |
|
|
|
|
|
|
|
β, градусы |
86 ± 5 |
|
|
|
|
|
|
||
χ2 |
(5.25 ± 3.40)×10-3 |
|
|
|
|
|
|||
a Показаны средние значения ± 2×СО. |
|
|
|
|
|
|
|
||
b Coulter MAX M не определяет СО для распределения по HbC. |
|
|
|
||||||
|
104 |
|
|
|
эспер. теория |
χ2 |
|
||
|
|
|
|
|
1. |
|
|
2.7×10-3 |
|
|
|
|
|
|
2. |
|
|
9.9×10-3 |
|
|
|
|
|
|
3. |
|
|
1.4×10-2 |
|
|
103 |
|
|
|
|
|
|
|
|
I(θ ) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Интенсивность |
102 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
101 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
50 |
55 |
|
|
|
Угол рассеяния θ, градусы |
|
|
|
|||
Рис. 44. Три примера измеренных индикатрис в логарифмическом масштабе вместе с ближайшими теоретическими индикатрисами. Приведены χ2 расстояния, значения остальных параметров эритроцитов – в тексте.
HbC = 38.9 г/дл, β = 89.3°. Эти примеры не типичные, а скорее экстремальные, соответствующие относительно хорошему (№1) и плохому (№2, №3) согласию эксперимента и теории. Они также покрывают практически весь диапазон величин измеренных индикатрис. Результаты χ2 метода применительно к 3000 экспериментальных индикатрис представлены в таблице 15 – приведены средние значения и ширины распределений по каждому параметру. Для сравнения мы исследовали эту же пробу двумя другими методами. Один основан на сферизации эритроцитов с сохранением объёма и определении размера и показателя преломления с помощью СПЦ (см. подраздел 3.1.2, подробное описание в [219]). Другой – это коммерческий гематологический анализатор Coulter MAX M (Beckman Coulter Corporation), который определяет распределение по V и среднее значение HbC.
159
|
120 |
|
|
|
|
|
|
110 |
|
|
|
|
|
3 |
100 |
|
|
|
|
|
V, мкм |
90 |
|
|
|
|
|
Объём |
80 |
|
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
30 |
|
70 |
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
50 |
|
|
|
|
|
|
60 |
|
60 |
|
|
|
|
70 |
|
6.0 |
6.5 |
7.0 |
7.5 |
8.0 |
8.5 |
|
|
|
Диаметр D, мкм |
|
|
|
Рис. 45. Совместное распределение эритроцитов по объёму и диаметру.
χ2 метод определяет несколько параметров эритроцитов, некоторые из которых можно измерить независимо только трудоёмкими микроскопическими методами. Пока мы не использовали подобные методы, поэтому можем сверить только результаты для V и HbC, измеряемые с помощью проточного цитометра. Результаты двух независимых известных методов очень близки, поэтому мы считаем их эталонными. χ2 метод приводит к правильным средним значениям, но в 1.5 раза бóльшим СО. Дополнительно рассмотрим двухмерное распределение по V и D на рис. 45. Выраженная линейная корреляция между V и D согласуется с литературными данными [210], а артефакты в виде узких максимумов вызваны несовершенством χ2 метода.
Интервалы, приведённые в таблице 15, ýже чем исходные интервалы для построения базы данных (см. подраздел 3.3.2) для всех параметров, кроме b и HbC.
Нестабильность b обсуждается в подразделе 3.3.3 – χ2 метод не способен точно определять этот параметр. Распределение по HbC показано на рис. 46 – оно широкое,
но явно сконцентрировано вблизи среднего значения. Следовательно результаты χ2 метода для всех параметров, кроме b, по крайней мере, разумны. Главный недостаток этого метода – необычно большие СО для всех параметров – можно объяснить неточностью одиночного решения обратной задачи светорассеяния. В качестве дополнительного обоснования выбора узкого диапазона углов β, мы приводим распределение по β на рис. 47. Видно, что практически все эритроциты отклоняются не более чем на 10° от предпочтительной ориентации диаметром вдоль потока.
160
|
140 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Количество |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
60 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
28 |
30 |
32 |
34 |
36 |
38 |
40 |
42 |
|
26 |
||||||||
|
|
|
Концентрация гемоглобина HbC, г/дл |
|
|
||||
Рис. 46. Распределение эритроцитов по концентрации гемоглобина. |
|
|
||||||
|
200 |
|
|
|
|
|
|
|
|
150 |
|
|
|
|
|
|
|
Количество |
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
50 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
78 |
80 |
82 |
84 |
86 |
88 |
90 |
|
76 |
|||||||
|
|
|
Угол ориентации β, градусы |
|
|
|||
Рис. 47. Распределение эритроцитов по углу ориентации β.
Помимо теоретических ошибок, обсуждаемых в подразделе 3.3.3, погрешности возникают ввиду экспериментальных ошибок, т.е. разницы между реальной и измеренной на СПЦ индикатрисами. Эти ошибки связаны, в основном, с отклонением траектории эритроцита от оси капилляра СПЦ. Обозначим множество индикатрис эритроцитов для всех возможных наборов параметров как Mer (без учёта экспериментальных ошибок). Мы считаем, что теоретические индикатрисы принадлежат этому множеству, т.е. пренебрегаем погрешностью МДД. Тогда экспериментальные ошибки можно разделить на две части: (1) сдвиг до другой индикатрисы из Mer и (2) сдвиг за пределы Mer. Чтобы это разделение было однозначным, можно, например, выбирать часть (2) с минимальным значением χ2. Обе части ведут к погрешностям в измеряемых параметрах, однако есть одно важное отличие: часть (2) приводит к бóльшим χ2 по сравнению со значениями в таблице 14. Следовательно эту часть можно контролировать, например, экспериментальные
161