Глава 4. Гранулоциты
4.1. Введение в гранулоциты*
Гранулоциты это самый многочисленный тип лейкоцитов, состоящий из трёх подтипов: нейтрофилов, эозинофилов и базофилов. Их количество относительно всех лейкоцитов в нормальных условиях лежит в диапазонах 46–73%, 0–4.4% и 0.2–1.2% соответственно [239]. Далее мы подробно опишем функцию и морфологию каждого подтипа гранулоцитов и рассмотрим литературные данные по характеризации гранулоцитов оптическими методами.
4.1.1. Нейтрофилы
Основная функция нейтрофилов – защищать организм от инфекционных агентов. Для этого нейтрофил должен почувствовать инфекцию, мигрировать к очагу и уничтожить инфекционный агент. Последнее обычно происходит фагоцитозом агента с последующим выделением содержимого гранул в фагоцитарные пузырьки для его умерщвления [240].
Типичный диаметр нейтрофила в мазках крови составляет 10–15 мкм [240]. Однако Тинг-Билл (Ting-Beall) и др. [241] показали, что нормальный нейтрофил во взвеси имеет объём 299 ± 64 мкм3, что соответствует диаметру 8.3 ± 0.6 мкм (интервалы соответствуют двум стандартным отклонениям). Близкое значение диаметра зрелого нейтрофила (8.3 ± 1.2 мкм) было получено Бредеру (Brederoo) и др. [242] с помощью электронного микроскопа. Ядро чётко разделяется на доли, соединённые тонкими филаментами, в среднем для 5% нейтрофилов оно состоит из одной доли, 35% – двух, 41% – трёх, 17% – четырёх, 2% – пяти и более долей [243]. Площадь сечения ядра на микроскопических изображениях составляет примерно 20% от клетки [242].
Нейтрофилы содержат два основных класса гранул: азурофильные и специфические, хотя можно указать ещё несколько второстепенных классов [242,244,245]. Азурофильные гранулы больше и более плотные чем специфические, а их количества относятся как 1/2–1/3 [246]. Типичный размер азурофильных гранул 500 нм, а специфические – это либо шары размером 200 нм (Ливсей (Livesey) и др. [244] приводят диапазон 100–250 нм), либо палочки (130×1000 нм) [247]. В среднем
* Часть этого раздела опубликова в Semyanov K.A., Zharinov A.E., Tarasov P.A., Yurkin M.A., Skribunov I.G., van Bockstaele D.R., Maltsev V.P. Optics of leucocytes. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. – London: Springer, 2006 – P.253-264.
167
сечение клетки содержит 200–300 гранул [247], а всего в клетке их 1900–6300 с суммарным объёмом 30 мкм3 [246]. Все гранулы имеют трёхслойную мембрану толщиной около 8 нм, в некоторых присутствуют кристаллические включения [245]. Азурофильные гранулы в основном расположены вблизи поверхности клетки, а специфические – ближе к центру [246].
4.1.2. Эозинофилы
Изначально эозинофилы определялись по своим характерным гранулам в цитоплазме, которые имеют высокое сродство к эозину – отрицательно заряженному красителю. Они малочисленны в здоровом организме, но становятся заметны в периферической крови и тканях при различных заболеваниях, таких как аллергия, воспалительные реакции на многоклеточные гельминты и некоторые кожные и злокачественные заболевания. Накапливается всё больше доказательств того, что эозинофилы являются главными эффекторными клетками при аллергических и неаллергических воспалениях, а также при паразитических заболеваниях [248].
В мазках здоровой периферической крови эозинофилы имеют размер 10–15 мкм [240], но некоторые исследователи приводят значение 8 мкм [248]. Их ядро обычно двудольное, но также встречаются трёх- и более дольные [248,249].
Гранулы эозинофилов можно разделить на три основных класса: кристалловидные, первичные и малые. Кристалловидные гранулы имеют диаметр 0.5– 0.8 мкм [248] (Папелс (Puppels) и др. [249] приводят другой диапазон: 0.9–1.3 мкм) и состоят из кристаллической электроноплотной сердцевины, окружённой электронопрозрачным матриксом. В каждой клетке содержится примерно 200 кристалловидных гранул [248,249]. Первичные гранулы имеют диаметр 0.1–0.5 мкм и малочисленнее кристалловидных, а малые гранулы ещё меньше первичных [248]. Гранулы однородны по размеру и равномерно распределены по цитоплазме [243], более того они могут практически полностью её заполнять [250]. И в эозинофилах, и в нейтрофилах присутствуют второстепенные типы гранул – липосомы и секреторные пузырьки [251].
4.1.3. Базофилы
Базофилы могут фагоцитировать сенсибилизированные эритроциты, но имеют меньшую фагоцитарную активность чем другие гранулоциты и не имеют многих антибактериальных и лизосомальных ферментов. Базофилы встречаются в тканях, в которых происходит воспаление, вызванное гиперчувствительностью к белкам, контактной аллергией или отторжением кожного аллотрансплантата [251].
168
Обычно приводится диаметр базофилов в периферической крови равный 10– 15 мкм [240,252], однако Галли (Galli) и др. [253] получили диапазон размеров 5–7 мкм на основе ультраструктурного подхода. Ядро обычно состоит из 2 или 3 долей [240], но их сегментация менее выраженная, поэтому ядро имеет форму букв ‘S’ или ‘J’ [254].
Характерные гранулы в цитоплазме это электроноплотные круглые, овальные и угловатые структуры, ограниченные мембранной и имеющие размер до 1.2 мкм [254] (Дигс (Diggs) и др. [243] приводят интервал размеров 0.2–1.0 мкм). Некоторые гранулы имеют внутреннюю структуру – плотные частицы (размером 113–260 Å [254]) в менее плотном матриксе [253]. Вторым, относительно малочисленным типом гранул являются малые гранулы, расположенные, в основном, между долями ядра и состоящие из однородного материала небольшой плотности [253,254]. Кроме гранул в цитоплазме зрелых человеческих базофилов содержатся: гликогенные частицы, митохондрии, свободные рибосомы и малые везикулы; изредка встречаются липосомы [253].
4.1.4. Оптическая характеризация гранулоцитов
Светорассеяние взвесью гранулоцитов применялось в кинетических исследованиях. В частности, интенсивность светорассеяния может использоваться как мера агрегации [255] и изменения формы [256] нейтрофилов. Было показано, что дегрануляция нейтрофилов коррелирует с интенсивностью рассеяния вбок [257], а агрегация гранулоцитов – с экстинкцией [258]. Исследования биологии нейтрофилов с помощью проточных цитометров обсуждаются в обзоре Карулли (Carulli) [259].
В проточных цитометрах гранулоциты можно отделить от других лейкоцитов по бóльшим сигналам рассеяния вперёд и вбок (кроме базофилов, которые попадают в область лимфоцитов) [260]. Для дальнейшего разделения гранулоцитов на подтипы требуется измерение дополнительных параметров. Один из методов [260] основан на измерении количества CD45 антигена на поверхности клетки, используя меченые моноклональные антитела. Эозинофилы, лимфоциты и моноциты экспрессируют больше CD45 чем нейтрофилы и базофилы. Другой параметр – автофлуоресценция. Её бóльшую величину для эозинофилов можно использовать для отделения их от остальных лейкоцитов [261,262], однако этот параметр не надёжен, так как он может измениться при химической обработке клеток или использовании флуоресцентных меток. Тем не менее в комбинации с измерением экспрессии CD16b (специфичный для нейтрофилов) или CD49d (специфичный для эозинофилов) он позволяет надёжно разделять нейтрофилы и эозинофилы [263].
Новый параметр светорассеяния, деполяризованное боковое рассеяние (I ), был
предложен де Гротом (de Grooth) и др. [264]. Он позволяет разделять нейтрофилы и
169
эозинофилы за счёт большего значения I для последних, что было реализовано в виде цитометрического протокола [9,262]. Хотя интуитивно кажется понятным, что большее
I эозинофилов вызвано бóльшим размером их гранул [264], насколько нам известно, строгое объяснение этого эмпирического факта не проводилось. Более того, как мы покажем в разделе 4.2, зависимость I от размера гранул отнюдь не тривиальная.
Эозинофилы экспрессируют на своей поверхности несколько рецепторов из подсемейства CD2: NTB-A, CD224 (2B4), CD84, CD58 и CD48. Ни базофилы, ни нейтрофилы не экспрессируют NTB-A. CD224 экспрессируется базофилами, но не нейтрофилами, а CD84, CD58 и CD48 экспрессируются всеми гранулоцитами. Следовательно наличие NTB-A можно использовать для идентификации эозинофилов, а отсутствие CD224 – нейтрофилов [265].
Один из первых надёжных методов идентификации базофилов в проточном цитометре основан одновременно на малой экспрессии CD45 и наличии IgE на поверхности клетки, что может быть дополнено малой интенсивностью бокового рассеяния (по сравнению с остальными гранулоцитами) [266]. Другой метод основан на экспрессии CRTH2 (молекула гомологичная рецептору хемоаттрактанта, экспрессируемая Th2 клетками), которая также экспрессируется на Th2 клетках и эозинофилах [267]. Для идентификации базофилов определение CRTH2 сочетается с отсутствием CD3 и малой интенсивностью бокового рассеяния для исключения Th2 и эозинофилов соответственно.
Интенсивность светорассеяния измерялась во всём диапазоне углов рассеяния для гранулоцитов и лимфоцитов, и рассматривалось влияние ориентации на интенсивность бокового рассеяния для разных экспериментальных конфигураций [268].
170