4.2.Теоретическое исследование светорассеяния простой моделью гранулоцита – зернистым шаром*
Вданном разделе приведены результаты обширного МДД моделирования светорассеяния зернистым шаром. Мы вычисляем интенсивности полного и деполяризованного бокового рассеяния как функции размера и показателя преломления клетки и гранул и объёмной доли гранул. Используя типичные литературные данные по морфологии гранулоцитов, показано, что различие в экспериментально измеряемых сигналах нейтрофилов и эозинофилов можно полностью объяснить разным размером гранул. Более того вычисленная степень деполяризации численно согласуется с литературными экспериментальными данными. Используя простые теории – приближение Релея-Дебая-Ганса и его расширение до второго порядка, мы выводим аналитические выражения для сигналов бокового рассеяния. Эти выражения качественно описывают поведение сигналов, вычисленных МДД, при изменении параметров модели, а в некоторых случаях даже согласуются численно. В завершение, мы приводим и обсуждаем зависимость эффективности экстинкции и параметра асимметрии от размера и объёмной доли гранул.
4.2.1. Введение
Моделирование светорассеяния однородными частицами простой формы относительно легко (см. раздел 1.3). К сожалению, большинство природных частиц неоднородны и обладают сложной формой, существенную их часть можно описать как матрикс (основная среда) с многочисленными включениями (гранулами). Существует несколько приближений для моделирования светорассеяния такими объектами, которые относятся к одному из двух взаимосвязанных классов: ТЭС [117,269,270] или теории переноса излучения [271]. Последние особенно актуальны при рассмотрении бесконечной среды, или когда положение гранул флуктуирует с заметной амплитудой за время измерения.
Однако во многих случаях ни одно из этих приближений не достаточно точнó, и требуется использовать строгие методы моделирования светорассеяния. ОММЧ позволяет моделировать кластеры шаров [87,187], что является частным случаем зернистых частиц, когда матрикс это вакуум. Недавно Мищенко и др. [272] изучали светорассеяние такими кластерами с акцентом на проверку теорий переноса излучения.
* По результатам данного раздела готовится статья в Optics Express: Yurkin М.А., Semyanov K.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Light scattering by granulated spheres applied to discriminate subtypes of granulated blood cells.
171
Помимо этого только общие методы, такие как КРВО или МДД, применимы к зернистым частицам произвольной формы. Большинство исследователей, изучавших зернистые частицы, рассматривают астрофизические или атмосферные приложения [77,117,270,272], в то время как наше главное приложение– светорассеяние биологическими клетками – изучено намного меньше.
Биологические частицы в жидкости обладают важной особенностью при моделировании светорассеяния – их относительный показатель преломления близок к единице. Это ускоряет строгие методы (см. разделы 2.4 и 2.6) и улучшает точность ТЭС и других приближённых методов. Моделирование светорассеяния биологическими клетками с помощью КРВО проводилось в нескольких работах Дана (Dunn) и сотрудников (подытожены в [273]). Насколько нам известно, это единственное исследование, в котором при строгом моделировании светорассеяния рассматривались клеточные органеллы и гранулы. Его основной вывод состоит в том, что боковое рассеяние биологическими клетками определяется, в основном, гранулами, что согласуется с общими понятиями проточной цитометрии [2]. Однако исследовалась зависимость только от объёмной доли, но не от размера гранул.
Исследование светорассеяния зернистыми биологическими клетками мотивируется несколькими эмпирическими методиками, которые используют зависимость сигналов светорассеяния, измеряемых проточным цитометром, от характеристик гранул [264,274-276]. Все эти методики успешно применяются на практике, но не имеют строгого теоретического обоснования. В частности, образование белковых включений, синтезируемых клетками E. coli, коррелирует с интенсивностью рассеяния вперёд [275,276], что можно качественно объяснить увеличением полного количества рассеивающего вещества внутри клеток. Вероятно самое поразительное применение светорассеяние для характеризации зернистых клеток это результаты де Грота, Терстапена (Terstappen) и сотрудников [9,262,264], которые показали, что нейтрофилы и эозинофилы различаются по их I . Сузуки (Suzuki) и Егучи (Eguchi) обобщили этот результат на другие биологические виды [274]. Величины сигналов светорассеяния приведены де Гротом и др. [264] в произвольных единицах, следовательно их можно сравнивать с другими работами только качественно. Однако отношение сигналов, которое тоже приведено, можно численно сравнивать с предсказаниями любой модели, тем самым обеспечивая её строгую проверку.
В этом разделе мы преследуем две цели: получить общее понимание светорассеяния зернистой частицей с малым показателем преломления и много больше длины волны и строго объяснить различия в I между эозинофилами и нейтрофилами.
172
mg dg
mc m0 
Dc
Рис. 51. Модель зернистого шара. Все гранулы одинаковы и случайно расположены.
Для этого мы описываем простую модель гранулоцита в подразделе 4.2.2, а в подразделе 4.2.3 приводим определение сигналов полного и деполяризованного бокового рассеяния, измеряемых проточным цитометром, и выражения для этих сигналов, полученные с помощью приближённых методов. Результаты обширного МДД моделирования приведены в подразделе 4.2.4 в сравнении с приближёнными теориями и известными экспериментальными данными. В подразделе 4.2.5 мы приводим выводы и обсуждаем перспективы характеризации зернистых частиц, в частности, гранулоцитов, на основе светорассеяния.
4.2.2.Простая модель гранулоцита
Вкачестве модели гранулоцита мы используем зернистый шар (см. рис. 51), который не имеет ядра, а все его гранулы одинаковы и случайно расположены. Тем самым мы идём на компромисс между реалистичной формой (см. [273]) и общим фундаментальным подходом (см. [272]): мы можем изучать зависимость светорассеяния независимо от каждого параметра частицы, и в то же время наши результаты численно описывают, по крайней мере, степени деполяризации нейтрофилов и эозинофилов (см. подраздел 4.2.4).
Опишем параметры модели по умолчанию: диаметр клетки Dc = 8 мкм и объёмная доля гранул f = 0.1 соответствуют литературным данным по морфологии как нейтрофилов, так и эозинофилов (см. раздел 4.1). Дан собрал информацию о показателях преломления клеточной цитоплазмы и органелл из нескольких источников [273], но разброс приведённых данных довольно большой, что усложняет выбор конкретного значения. Мы выбрали показатель преломления цитоплазмы,
относительно внешней среды, mc = 1.015, что соответствует значениям полученным подгонкой модели многослойного шара к экспериментальным индикатрисам
173
лимфоцитов [37,277]. Для гранул мы выбрали наибольшее возможное значение, как если бы гранулы состояли полностью из белков, mg = 1.2. Этот выбор преувеличивает эффекты светорассеяния гранулами, но, как мы покажем, все выводы верны и при меньшем mg. В данном разделе мы полностью пренебрегаем поглощением и используем длину волны 0.66 мкм, что соответствует 0.4936 мкм в среде. Основной аргумент это диаметр гранул dg, который изменяется от 0.075 до 2 мкм. Нижняя граница этого диапазона определяется размером диполя в МДД – для всех вычислений мы использовали d = 0.041 мкм, что соответствует dpl = 12. Конкретный результат зависит от случайного положения гранул, поэтому мы повторяем каждое вычисление
10 раз и показываем среднее ± 2×СО для каждой характеристики рассеяния.
Дополнительно мы вычислили значение для dg = 0, применяя теорию Ми к однородному шару, показатель преломления которого вычисляется с помощью ТЭС Максвелла-Гарнетта [формула (46)]. Поскольку показатели преломления близки к единице, различия между разными ТЭС незначительны.
Также мы варьировали некоторые параметры от их значений по умолчанию. Чтобы ограничить количество моделей и время вычислений, мы изменяли каждый параметр по отдельности при постоянных остальных. При этом для каждого набора параметров моделировался полный диапазон dg. Мы использовали четыре дополнительных значения f : 0.02, 0.05, 0.2 и 0.3, два Dc: 4 и 14 мкм, два mg: 1.1 и 1.15, и
один mc = 1, т.е. отсутствие цитоплазмы (на самом деле использовался mc = 1.000001 изза ограничений текущей программы).
Все вычисления проводились программой ADDA 0.76 используя встроенный генератор гранул (см. подраздел 2.4.2). Для каждой частицы вычислялись: Qext, <cosθ >
и вся матрица Мюллера для всех углов рассеяния с шагами 0.5° и 5° по θ и ϕ соответственно. Более того мы использовали шаг 0.5° по ϕ вблизи направления рассеяния вбок, чтобы точно вычислить сигналы, описанные в подразделе 4.2.3. Типичное время моделирования одной частицы – полчаса на 8 узлах кластера LISA (см.
параграф 2.4.3.1), но при Dc = 14 мкм оно составляло примерно 1.5 часа на 16 узлах.
4.2.3. Ортогональное светорассеяние
Мы определяем сигналы бокового рассеяния так же, как это делал де Грот и др. [264]. Падающий свет распространяется вдоль оси z и линейно поляризован вдоль оси x, а частица находится в начале координат. Направление рассеяния вбок совпадает с осью y, сфокусированная на частицу линза собирает рассеянный свет на фотоприёмник, при этом они оба расположены соосно с осью y. Прямоугольная диафрагма,
174
расположенная перед линзой, ограничивает собираемые углы рассеяния интервалами
θ = 90° ± θ и ϕ = 90° ± ϕ; по умолчанию θ = ϕ = 25°. Измеряемые сигналы это полная интенсивность бокового рассеяния ISS и, когда перед фотодетектором помещён поляризатор, поляризующий вдоль оси z, полная интенсивность деполяризованного бокового рассеяния I . Степень деполяризации определяется как DSS = I /ISS.
В исходной работе [264] выражение для ISS и I выводится в терминах амплитудной матрицы рассеяния и приведено с опечаткой в одном знаке. Поэтому мы выводим эти выражения заново в терминах матрицы Мюллера. Обозначим радиус-
вектор точки на линзе r, а направление рассеяния n = r/r, соответствующее углам рассеяния θ и ϕ. Введём единичные вектор e и e|| перпендикулярные и параллельные плоскости рассеяния соответственно – они являются локальным базисом для рассеянной волны в точке r, т.е. {e , e||, n} это правосторонний ортонормированный базис (согласно Борену и Хафмену [14]). Эти вектора связаны с базисными векторами сферической системы координат: e|| = eθ, e = −eϕ . Считаем, что падающее электрическое поле имеет единичную амплитуду, тогда две компоненты рассеянного электрического поля в точке r (перед линзой) выражаются следующим образом:
Esca = (S |
4 |
cosϕ + S sin ϕ) |
eikr |
, |
Esca = (S |
2 |
cosϕ + S |
3 |
sinϕ) |
eikr |
. |
(187) |
|
|
|||||||||||
|
1 |
− ikr |
|
|| |
|
|
−ikr |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Линза поворачивает вектор распространения рассеянной волны с n до ey вместе с вектором электрического поля.
Введём следующие вспомогательные единичные вектора: |
|
e1 = (ey ×n) |ey ×n| , e2 = n ×e1 , e3 = ey ×e1 , |
(188) |
образующие правосторонние ортонормированные базисы {e1, e2, n} и {e1, e3, ey}.
Преобразование рассеянного поля в базисе {e , e||, n} в электрическое поле на детекторе
в базисе {ez, ex, ey} (компоненты Ezdet |
и Exdet ) происходит в несколько этапов |
(189) |
||
{e ,e|| ,n} →{e1,e2 ,n} →{e1,e3 |
,ey } →{ez ,ex ,ey }, |
|||
Rη (n) |
линза |
Rη |
(ey ) |
|
1 |
|
2 |
|
|
где Rη(e) обозначает поворот на угол η вокруг вектора e, который также изменяет компоненты электрического поля. Линза не изменяет компоненту электрического поля вдоль e1 и непосредственно отображает компоненту вдоль e2 в компоненту вдоль e3.
Следовательно компоненты Edet |
и Edet |
можно получить из Esca |
и |
Esca |
поворотом |
z |
x |
|
|
|| |
|
системы координат на угол η = η1 + η2: |
|
|
|
|
|
Ezdet = Esca cosη + E||sca sinη , |
Exdet = −Esca sinη + E||sca cosη . |
|
(190) |
||
175
Из геометрических соображений легко показать, что
tanη1 = e y e||y |
= −secθ cotϕ , tanη2 = nz nx = secϕcotθ , |
|||||
cosη = |
|
|
cosθ cosϕ |
, sinη = − |
sinθ +sinϕ |
. |
1 |
+ sinθ sin ϕ |
|
||||
|
1+sinθ sinϕ |
|||||
Разрешённые по углу полная и деполяризованная интенсивности следующим образом:
(191)
(192)
выражаются
JSS = |
|
Exdet |
|
2 + |
|
Ezdet |
|
2 , J = |
|
Ezdet |
|
2 . |
(193) |
|
|
|
|
|
|
Используя формулы (187), (190) и (193) и определение матрицы Мюллера через амплитудную матрицу рассеяния [14], получаем:
|
|
|
|
J |
SS |
(θ,ϕ)= |
1 |
[S |
+ S cos(2ϕ) + S |
sin(2ϕ)], |
(194) |
||||
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
k 2r2 |
11 |
|
12 |
13 |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
J |
|
(θ,ϕ)= |
1 |
{S |
− S |
|
cos(2η) + S |
|
sin(2η) |
|
|
||||
2k 2r2 |
|
|
|
(195) |
|||||||||||
|
|
|
11 |
|
21 |
|
|
|
|
31 |
|
|
|||
+ [S12 − S22 cos(2η) + S32 sin(2η)]cos(2ϕ) + [S13 − S23 cos(2η) + S33 sin(2η)]sin(2ϕ)}. |
|||||||||||||||
Тот же результат можно получить, используя формализм матриц Мюллера. |
|||||||||||||||
|
|
Итоговые сигналы, измеряемые детектором, пропорциональны интенсивностям, |
|||||||||||||
проинтегрированным по апертуре: |
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
ISS , =κ ∫∫dϕ dθ r2 sinθ JSS, (θ,ϕ) . |
(196) |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
аперт. |
|
|
|
|
|
|
Мы используем коэффициент пропорциональности κ = k 2/(4 θ |
ϕ) – тогда ISS и I это |
||||||||||||||
линейные комбинации элементов матрицы Мюллера, усреднённые по апертуре. Более того в пределе бесконечно малой апертуры выражения особенно упрощаются:
θ, ϕ → 0 ISS → S11 − S12 , I → S11 + S21 − S12 − S22 , |
(197) |
где все элементы матрицы Мюллера рассматриваются точно в направлении рассеяния вбок. Конкретное значение κ ни на что не влияет, так как мы всегда рассматриваем либо качественное поведение ISS и I , либо относительные величины.
Далее сформулируем экспериментальные выводы де Грота и др. [264], которые мы объясним строгим моделированием на основе МДД в подразделе 4.2.4. На графике в координатах ISS и I для пробы, содержащей нейтрофилы и эозинофилы, эти два подтипа чётко разделяются – сигналы ISS примерно одинаковые, а I – больше для эозинофилов. Более того, имеется существенная корреляция между I и ISS для обоих подтипов. Различие между ними особенно выражено в терминах DSS – её средние значения равны 0.044 и 0.013 для эозинофилов и нейтрофилов соответственно (усреднение проводилось по одной пробе). Авторы также показали, что DSS
176