индикатрисы, для которых χ2 больше определённого уровня можно отбросить (см. подраздел 3.2.2) или обрабатывать по-другому. Часть (1), напротив, нельзя определить на основе анализа индикатрисы. Для уменьшения этой ошибки необходимо улучшить оптическую и гидродинамическую систему СПЦ.
Сравнивая значения χ2 для экспериментальных и теоретических индикатрис, можно заключить, что ошибки типа (2) значимы, однако тяжело сделать какие-либо заключения об ошибках типа (1). Мы провели упрощённое теоретическое моделирование искажений оптической системы СПЦ, и предварительные результаты говорят о том, что ошибки типа (2) тоже существенны для настоящего прибора (данные не приведены). Однако требуется дальнейшее исследование, прежде чем делать определённые выводы.
3.3.5. Эмпирическая процедура определения диаметра эритроцитов
Ранее была предложен эмпирический способ определения диаметра эритроцита по положению последнего пика (ППП) в амплитудном спектре Фурье его индикатрисы [219]. Исходно этот метод разрабатывался для шаров, поэтому его применение к эритроцитам исключительно эмпирическое. В этом подразделе мы уточняем и проверяем этот метод, использую базу данных теоретических индикатрис.
Сначала вкратце опишем процедуру. Индикатриса рассматривается в интервале
[5°,50°], который основан на предыдущем опыте использования спектрального метода для определения размера частиц [38,219]. Во-первых, индикатриса умножается на функцию wF(θ ) = θ2.5, которая выбрана эмпирически для компенсации естественного спада I(θ ) с увеличением θ и тем самым для более надёжного определения ППП. Вовторых, масштабированная индикатриса нормализуется линейным преобразованием, чтобы иметь нулевое среднее и единичное СО в данном угловом интервале. Нормализация требуется для того, чтобы использовать одинаковый уровень отсечки при определении ППП для всех эритроцитов. В-третьих, нормализованная индикатриса умножается на весовую функцию, соответствующую окну Хенинга [формула (178)], что приводит к
Imod (θ) = w(θ)[I (θ)wF (θ)− <IwF > ] СО(IwF ) . |
(184) |
В завершение вычисляется амплитудный спектр Фурье |
модифицированной |
индикатрисы и определяется последний пик, амплитуда которого выше уровня отсечки.
Последний определяется эмпирически и составляет 5×10−4 для данной процедуры модификации индикатрисы. Для примера мы приводим спектр трёх
162
|
10-1 |
|
|
|
|
|
|
10-2 |
|
|
|
последний пик |
|
|
|
|
|
|
|
|
Фурье |
|
|
|
|
|
|
Амплитуда |
10-3 |
|
|
|
уровень отсечки |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
10-4 |
|
|
|
|
|
|
10-5 |
|
|
|
|
|
|
0.0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
|
|
Частота, градус-1 |
|
|
|
Рис. 48. Амплитудный спектр Фурье трёх модифицированных теоретических индикатрис эритроцитов. Показаны последние пики и уровень отсечки.
Диаметр D, мкм
10 |
Теоретические индикатрисы |
Линейная подгонка
9
8
7
6 |
|
|
|
0.20 |
0.25 |
0.30 |
0.35 |
|
Положение последнего пика, градус−1 |
|
|
Рис. 49. Положение последнего пика амплитудного спектра Фурье модифицированной индикатрисы и диаметр для 40 000 моделированных эритроцитов. Также показана линейная подгонка через все точки.
модифицированных теоретических индикатрис эритроцитов на рис. 48. Видно, что для этих модельных данных последний пик чётко определён.
Мы вычислили ППП для каждой из 40 000 теоретических индикатрис и отложили их как функцию от D на рис. 49. Процедура обращения основана на выраженной линейной корреляции между ППП и D, которая означает, что ППП практически полностью определяется самым большим размером эритроцита, т.е. диаметром, и слабо
зависит от всех остальных параметров. Линейная подгонка с формулой |
|
D = ППП×28.643 мкм градус |
(185) |
163
|
400 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
χ2 метод (7.42 ± 1.48) |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
спектрал. (7.00 ± 1.86) |
|||
|
300 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Количество |
200 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
5.5 |
6.0 |
6.5 |
7.0 |
7.5 |
8.0 |
8.5 |
9.0 |
9.5 |
10.0 |
|
5.0 |
||||||||||
|
|
|
|
|
Диаметр D, мкм |
|
|
|
|||
Рис. 50. Распределение эритроцитов по диаметрам, полученное с помощью χ2 и спектрального методов. В легенде приведены средние значения ± 2×СО.
проведена на рис. 49. Использование формулы (185) для определения D всех моделированных эритроцитов приводит к следующим погрешностям: СМО = 0.27 мкм,
СКО = 0.028 мкм, СМОО = 2.7% и СКОО = 0.37%, что меньше чем теоретические погрешности χ2 метода (см. таблицу 14). Важно отметить, что формула (185) верна
только для конкретных λ и |
m0, использованных при моделировании |
(λ = 660 нм, |
m0 = 1.337). Но если переписать её в виде |
|
|
Dm0 |
λ = ППП×58.024 градус, |
(186) |
то коэффициент не должен зависеть от λ и m0, ввиду масштабной инвариантности светорассеяния (если предположить, что ППП определяется исключительно D). Однако, ввиду небольшой зависимости ППП от формы и показателя преломления эритроцита, повторение вышеописанной процедуры для базы данных индикатрис,
вычисленных для других λ и m0, приведёт к немного другому значению коэффициента в формуле (186).
Результат применения спектрального метода к той же пробе крови, как и в подразделе 3.3.4, представлен на рис. 50 в виде распределения по D, а для сравнения приведено распределение, полученное χ2 методом. Видно, что имеется систематическая разница примерно 0.5 мкм между двумя методами. Применимо к шарам спектральный метод устойчив к экспериментальным ошибкам, что является главной мотивацией его развития [38], но для эритроцитов он приводит к более широкому распределению по D чем χ2 метод. Поэтому сложно сказать, какой метод более точен, – оба необходимо улучшать. Более того требуется сравнение обоих
методов с микроскопическими методами измерения морфологии эритроцитов. На
164
данный момент можно сделать единственный вывод: оба метода приводят к разумным, хотя и не достаточно точным результатам. Это подтверждается тем, что спектральный метод использует только один коэффициент, полученный из теоретических индикатрис, в остальном же он не зависит ни от базы данных, ни от исходного интервала, из которого выбирался диаметр.
3.3.6. Выводы
Мы предложили расширенную четырёхпараметрическую модель формы эритроцита, в которой все величины, полученные микроскопическими измерениями, являются независимыми входными параметрами. Мы вычислили 40 000 индикатрис эритроцитов, случайно выбирая шесть параметров: четыре параметра формы,
концентрацию гемоглобина HbC и угол ориентации β, из интервалов, соответствующим литературным данным по здоровым человеческим эритроцитам. Для решения обратной задачи светорассеяния мы модифицировали ранее предложенный χ2 метод, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с теоретическими из насчитанной базы данных.
Мы использовали χ2 метод для характеризации эритроцитов в пробе крови, полностью определяя их форму, HbC и ориентацию в капилляре сканирующего проточного цитометра (СПЦ). Результаты для объёма и HbC были сравнены с другими методами – средние значения совпадают, но стандартные отклонения результатов χ2 метода примерно в 1.5 раза больше чем для эталонных методов. Это объясняется чувствительностью χ2 метода к несовершенству оптической системы СПЦ, однако этот вопрос требует дальнейшего исследования. Результаты для всех параметров разумные,
за исключением минимальной толщины, которая не может быть точно определена χ2 методом, ввиду низкой чувствительности индикатрисы к этому параметру.
Мы также использовали базу данных вычисленных индикатрис для уточнения и проверки ранее предложенного эмпирического метода определения диаметра эритроцита D по положению последнего пика (ППП) в амплитудном спектре Фурье модифицированной индикатрисы. Коэффициент пропорциональности между D и ППП, определённый линейной подгонкой для модельных данных, составляет
28.643 мкм градус. Применительно к той же пробе крови спектральный метод приводит к более широкому распределению по диаметру чем χ2 метод, также есть систематическая разница примерно 0.5 мкм между этими методами. Следовательно требуется дальнейшее улучшение обоих методов, а для проверки их точности необходим эталонный метод, например, на основе микроскопических измерений.
165
В этом разделе приведены последние результаты по характеризации эритроцитов
спомощью масштабного МДД моделирования. Но необходима дальнейшая работа по улучшению и подробной проверке предложенных методов. Эта работа включает следующее:
1)Ускорение χ2 метода. Текущая реализация данного метода требует немного меньше секунды на каждую экспериментальную индикатрису на современном ПК. Предварительная кластеризация базы данных может уменьшить необходимое число сравнений для нахождения теоретической индикатрисы на минимальном χ2 расстоянии, и тем самым уменьшить время вычислений на несколько порядков. В
частности, это позволит использовать χ2 метод в реальном времени одновременно с измерением индикатрис.
2)Улучшение точности χ2 метода. В настоящее время для характеризации используется только ближайшая индикатриса, в то время как использование нескольких ближайших индикатрис вместе с какой-нибудь интерполяцией может улучшить как точность определения параметров, так и надёжность, т.е. контроль над экспериментальными ошибками.
3)Исследование экспериментальных ошибок, т.е. влияния несовершенства оптической системы СПЦ и положения частицы в капилляре на индикатрису. Улучшение в этом направлении может быть связано либо с усовершенствованием оптической и гидродинамической системы СПЦ, либо с методом учёта этих ошибок, например, вводя дополнительный неизвестный параметр в процедуру обращения, такой как положение частицы в капилляре СПЦ.
4)Совмещение результатов спектрального и χ2 методов для более точного определения диаметра эритроцита. Это возможно, так как оба метода используют один и тот же экспериментальный сигнал, и это также может улучшить надёжность процедуры обращения.
5)Дополнительная проверка для многих проб крови. Она должна включать сравнение с другими надёжными методами, особенно с теми, которые способны определять морфологические параметры эритроцита (D, максимальная и минимальная толщины), например, с микроскопическими измерениями.
166