Обязанности микробиолога:
Создание лаборатории, соответствует нормативным стандартам.
Поддержание программы контроля качества, которая гарантирует точ- ность всех предлагаемых методик и тестов.
Обеспечение правильного сбора и транспортировки клинических образ- цов.
Обеспечение системы кратковременного и долговременного хранения клинических изолятов для обеспечения проведения дополнительных ис- следований.
Периодическая публикация антибиотикочувствительности и/или рези- стентности наиболее распространенных бактериальных изолятов в опре- деленном стационаре.
Обязанности клинициста:
Правильный сбор и транспортировка материала от больного.
Определение круга патогенов причастных к развитию заболевания и опо- вещение об этом врачей лаборатории.
Определение приоритетности запросов на исследование.
Создание открытой связи с сотрудниками лаборатории.
3. Структура бактериологической лаборатории.
=лаба и дополнительные помещения: для приготовления питательных сред, для стерилизации (автоклавная), для мытья лабораторной посуды и виварий, боксы.
В собственно лаборатории: термостат, холодильник, лабораторная мебель. На рабочем столе микроскоп, бактериологическую петлю, набор красителей, чистые предметные стекла, спиртовку, штатив для пробирок, дезинфицирующий раствор для отработанного материала и пипеток и дезинфицирующий раствор для обработки рук.
Тема № 1: «Микробиологическая лаборатория. Техника безопасности при работе с культурой патогенных микробов и газом. Иммерсионный микроскоп. Морфология бактерий. Микроскопический метод диагностики»
Разновидности микроскопических методов исследования микроорганизмов
Требования к осуществлению контроля биологической безопасности в бактериологических лабораториях
Основные задачи: предотвращение внутрилабораторных заражений; внутрилабораторной контаминации (загрязнения посто- ронними микробами) во время исследования; предупреждение распространения инфекций за пределы лаборатории.
Основные требования:
Работа в халатах, шапочках, сменке, без украшений. Рукава прикрывать одежду, волосы закрывать шапочкой.
В лабе чистоту и порядок. На лаб. столе нет посторонних предметов. Соблюдать тишину, сосредоточен и слушать указания преподавателя.
Все использованные предметы сразу обеззаразить, автоклавировать.
В конце привести в порядок рабочее место, обработать руки дезинфицирующим раствором.
По степени биологической опасности микроорганизмы :
1-я группа- возбудители особо опасных инфекций- чумы, натуральной оспы, желтой лихорадки.
2-я - возбудители высококонтагиозных эпидемических - сибирской язвы, бруцеллеза, малярии, сыпного тифа. Лабы имеют боксы и герметичные костюмы, особый режим работы.
3-я - возбудители инфекционных,но разработано эффективное лечение и профилактика, выделяемых в самостоятельные нозологические группы- брюшного тифа, шигеллеза, дифтерии=лабы со вторым.
4-я - условно патогенные микроорганизмы, возбудители оппортунистических инфекций- клебсиеллы, протей=лабы с первым уровнем биобезопасности. Специальное оснащение не надо.
Основные методы лабораторной диагностики инфекционных заболе ваний.
МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ – совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных свойств микробов .
Препараты для изучения убитых:
а) фиксированный мазок – на предметном стекле материал эмульгируют в физрастворе, фиксируют;
б) мазок из жидкого материала –без физраствора;
в) мазок из вязкого (гной, мокрота) – капля между двумя предметными стеклами, их разводят = два мазка;
г) тонкий мазок крови – кровь по предметному размазывают краем другого под 45º
д) толстая капля крови – каплю распределяют по предметному стеклу бакпетлёй по площади 1 см.
е) препарат-отпечаток – кусочек ткани прикладывают к стеклу;
ж) препарат-соскоб – кусочек ткани как мазок из вязкого;
з) препарат для электронной микроскопии – нанесение тончайшим слоем на специальную пленку, которая не поглощает электроны.
II. Препараты для изучения живых:
а) висячая капля – каплю жидкой культуры на покровном герметично накрывают предметным с лункой и переворачивают;
б) раздавленная капля – возле капли материала на предметном ребром ставят покровное стекло, придавливают каплю.
Общее увеличение = произведение увеличений объектива и окуляра.
Разрешающая способность–наименьшее расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно
Светлопольная микроскопия –с использованием излучения видимого спектра. Разрешающая способность 0,2 мкм.
Для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.
Увеличение обычного светового 400 раз, иммерсионного 1000 раз за счет капли иммерсионного масла - устраняет резкое изменение показателя преломления лучей в воздушной среде.
Темнопольная микроскопия = темнопольный фильтр или кондéнсор = основная часть лучей не проходит объект и не попадает в объектив, проходят в стороне от образца, но небольшая часть из-за дифракции рассеивается от препарата и попадает в объектив.
Разрешающая способность – 0,2-0,4 мкм.
Для изучения формы, размеров и подвижности живых, неокрашенных бактерий.
Поле темное, микроорганизмы – ярко светящиеся.
Фазово-контрастная– Разрешающая способность – 0,2 мкм.
Для изучения формы, подвижности и структуры живых неокрашенных прозрачных бактерий.
Перевод неуловимых фазовых изменений в прозрачных обьектах в уловимые интенсивности света.
Свет проходит через конденсор и кольцевую диафрагму- фокусируют его на образце. Часть света рассеивается, фаза колебаний смещается– это рассеянный свет. Другая часть попадает в объектив неизменённой – это фоновый свет.
Фазовое кольцо, при прохождении через которое фоновый свет смещается и его фаза становится такой как у рассеянного. Изображение в точках, где на фоновый накладывается рассеянный, становится заметно.. Дополнительно усиливают при помощи кольцевого нейтрального светофильтра.
Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).
Аноптальная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.
Люминесцентная микроскопия
Разрешающая способность – 0,1 мкм.
Для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций.
Основан на способности некоторых вещ. поглощать свет, а затем испускать с большей длиной волны. Препараты окрашивают флуорохромами (акридиновый оранжевый, аурамин).
В качестве источника УФ-света - ртутно-кварцевую лампу. Клетки светятся красным или зеленым светом.
Следом первый светофильтр, пропускающий только ультрафиолет или коротковолновой свет. Чтобы рассеянный не мешал, в окуляре второй светофильтр, отсекающий фиолетовый свет. В итоге не доходит свет от ртутной лампы, только вызванное им свечение синего цвета из-за люминесценции.
Электронная микроскопия
Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем, 1Å = 0,1нм = 10-4 мкм, 1 мкм=0,01мм).
Для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных макромолекул.
Малая длина волны электронов = высокая разрешающая способность.
Вместо света - поток электронов в безвоздушной среде. Источник электронов - вольфрамовая нить катода 2500-29000С температуры. Роль оптических линз - электромагниты. Вместо глаза электроны попадают на флуоресцирующий экран - металлическую пластину, покрытую тонким слоем сернистого цинка или минерала вилемита, или на фотопластинку.
Для исследования препаратов специальные пленки, проницаемые для электронов.
Длина волны уменьшается, разрешающая увеличивается. Изучаемый объект «прокрашивают» солями тяжелых металлов, делают ультратонкие срезы. Проходя через них, часть электронов задерживается. Хорошо отражающие электроны части клеток на экране светлые, плохо – темными. В сканирующих электронных микроскопах пучок электронов фокусируется в тонком зонде, который движется по поверхности образца. Изображение формируют те электроны, что отражаются от поверхности.
Порядок проведения иммерсионной микроскопии
1. Поднять конденсор микроскопа выше предметного стекла и полностью открыть диафрагму.
2. Включить осветитель и установить свет с помощью зеркала.
3. На мазок нанести каплю иммерсионного масла, поместить препарат на предметный столик микроскопа.
4. Поставить в рабочее положение иммерсионный объектив, маркированный черной линией.
5. Под контролем зрения, глядя сбоку, с помощью макровинта осторожно опустить тубус микроскопа до погружения иммерсионного объектива в каплю масла.
6. Глядя в окуляр, очень медленно поднимать тубус при помощи макровинта, пока не появится изображение объекта.
7. Далее провести точную фокусировку с помощью микровинта.
бактериоскопический для диагностики первичного сифилиса, острой мужской гонореи, туберкулеза, лепры, возвратного тифа;
вирусоскопический–вирусов в исследуемом материале электронным микроскопом. Находят внутриклеточные включения в пораженных клетках при вирусных инфекциях.
Включений Бабеша-Негри при бешенстве, гигантских клеток с внутриядерными включениями и большими ядрами при цитомегаловирусной инфекции=«совиный глаз».
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД в зав. от объекта исследования:
бактериологический– посев материала на искусственные питательные среды для диагностики холеры, брюшного тифа, дизентерии, туберкулеза .
вирусологический– заражение материалом куриных эмбрионов (для диагностики гриппа), культур клеток (аденовирусной инфекции, полиомиелита), лабораторных животных (клещевого энцефалита, бешенства).
микологический– посев материала с подозрением на грибковую инфекцию на питательные среды с идентификацией плесневых и дрожжеподобных грибов.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ – определение в сыворотке крови антител к возбудителю инфекционного заболевания. Ддля диагностики бруцеллеза, туляремии, ВИЧ-инфекции др.
АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКИЙ– определение состояния аллергии .
Кожно-аллергические пробы:
при туберкулезе – проба Манту с туберкулином;
при бруцеллезе – проба Бюрне с бруцеллином;
при туляремии – проба с тулярином;
при сибирской язве – проба с антраксином.