Окраска структурных элементов микробной клетки

Для обнаружения КАПСУЛ - метод БУРРИ-ГИНСА: в каплю туши, разведенной в 10 раз водой, вносят бактерии и распределяют их петлей; мазок высушивают, фиксируют (2-3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают 3-5 мин фуксином Пфейффера, промывают, высушивают;

На темном фоне препарата капсулы в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

ЖГУТИКОВ по направленному характеру движения в раздавленной и висячей каплях или окраски по МОРОЗОВУ: 1) обработка кислотой, оболочки и жгутики разрыхляются; 2) закрепление танином; 3) обработка азотнокислым серебром, окутывает жгутик + оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого.

СПОРЫ. Эндоспоры выдерживают длительное кипячение, горячего воздуха (140-150°С) и химических дезинфицирующих веществв.

Водным фуксином, водно-спиртовым метиленовым синим и по Граму не окрашиваются.

В мазках бацилл и клостридии простыми красителями=споры в виде бесцветных телец внутри вегетативных клеток или вне.

Окрашивать по методу Циля-Нельсена, для обесцвечивания после обработки фуксином Циля не 5%, а 1% серную кислоту. Эндоспоры, микобактерии туберкулеза в розовый.

Для спор метод по ОЖЕШКО: 1) протравка оболочки горячей кислотой; 2) окраска по Цилю-Нильсену.

При исследовании морфологии паразитов крови (спирохеты - бледная трепонема, простейшие - малярийный плазмодий) окраску по РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗА. Краска из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Окрашивает ЦИТОПЛАЗМУ в голубой, ЯДРА в красно-фиолетовый.

Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычно, фиксируют в ацетоне и наносят флюорохром на 20-30 мин. Сделанный промывают проточной, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Приготовление мазков из микроорганизмов, выросших на  жидких и плотных питательных средах – этапы.

Этапы посева в МПБ:

а) прокалить петлю. Приоткрыть чашку Петри с культурами и охложденной петлей набрать культуру из колонии №1. Закрыть чашку;

б) над пламенем спиртовки открыть пробирку с МПБ, внести петлю с куль- турой в глубину МПБ. Закрыть пробирку над пламенем спиртовки. Про- калить петлю.

Этапы посева на скошенный МПА:

а) набрать культуру из колонии №2 так же, как из колонии №1;

б) над пламенем спиртовки открыть пробирку со скошенным МПА. Внести петлю культуры до дна пробирки и, скользя петлей по поверхности агара зигзагообразно снизу вверх, сделать посев. Закрыть пробирку, прокалить петлю.

Посевы поместить в термостат при температуре 37°С на 24 часа.

Этапы приготовления мазка:

1. Собственно приготовление.

• на обезжиренном предметном стекле обвести границу мазка карандашом по стеклу;

• приготовление из жидкой питательной среды: прокалить петлю (при работе с одноразовыми не надо), над спиртовкой открыть пробку пробирки, обжечь края, набрать каплю культуры петлей. Снова обжечь края и закрыть пробкой. Пробирку в штатив, нанести каплю на предметное стекло и распределить петлей параллельными движениями. Прокалить петлю (при работе с одноразовыми в дезинфицирующий раствор);

• приготовление с плотной: прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробирку с физиологическим раствором, обжечь края пробирки и набрать петлей каплю физиологического. Обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Нанести каплю на предметное стекло. Прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробирку с плотной, обжечь края. С пов. взять петлей немного культуры, обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Внести культуру в каплю физ. раствора, распределить. Прокалить петлю.

1. Высушить высоко над пламенем спиртовки.

2. Фиксировать жаром. 3 раза внести в среднюю треть пламени на 1-2 секунды.

1. Приготовленные мазки окрасить простым методом. Промыть водой и высушить фильтровальной бумагой.

2. Микроскопировать приготовленные препараты.

Окраска мазка по методы Грама-Синёва.

1. На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)

2. Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)  

3. Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать

4. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).

5. Тщательно промыть дистиллированной водой.

6. На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)

7. Промыть и подсушить препарат

Тема 3

Питательные среды. Классификация.

По составу :

  1. Естественные = основа из натуральных продуктов: молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. 

  2. Синтетические = в составе только определенные, химически чистые соединения в указанных концентрациях. Животные [МПА или МПБ] и растительные (настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

  По консистенции:

  1. Жидкие для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов – мясо-пептонный бульон (МПБ), 1% пептонная вода.

нежная пленка=холера. При размножении может быть пленка.

2. полужидкие – полужидкий мясо-пептонный агар* (МПА с концентра- цией агар-агара до 1%);

3. Плотные среды  для выделения и изучения свойств чистых культур, т. к. на можно получить изолированный рост клеток в виде колоний. Мясо-пептонный агар (МПА) из жидких + агар-агара. Агар-агар из водорослей. Плотные = агар, желатин, силикагель. МПА (концентрация агар-агара 2-3%), кровяной агар.

 4. Сухие в виде порошков, хорошо растворяются в воде при комнатной. Сухой питательный агар, среду Эндо.

  По назначению среды подразделяются на:

  1. Универсальные (основные) для культивирования большинства. Мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА).

  2. Специальные - для выявления микроорганизмов или получения культуры с особыми свойствами.

   2а. Элективные (селективные) = среды Уилсона-Блэра,Эндо, чтоб обеспечить оптимальные условия для выращивания определенных. При посеве смеси различных микроорганизмов, раньше рост того вида, для которого будет избирательно пригодна + есть вещ., подавляющие другие. Среда Мюллера, селенитовая, Раппопорт, 1% пептонная вода и щелочной агар для холерных вибрионов, среда Плоскирева –брюшного тифа и дизентерии);

2б. Дифференциально-диагностические для изучения биохимических свойств и дифференцировки видов по характеру ферментативной акт. Среды с углеводами и спиртами, мочевиной. Эндо для кишечных бактерий, Левина, висмут-сульфит-агар (ВСА), Плоскирева, Гисса и др. Виды:

-среды с белками для определения гемолитических\протеолитич.свойств:молоко,кровяной агар.

-с углеводами, ферментативное расщепление=сдвиг рН

-для определения редицирующей способности с красками, обесцвечивающиеся при восстановлении и с нитратами для денитрифицирующей акт.

3. обогащения-Китта-Тароцци, способствуют размножению