учебники микра / Lektsii_Shvidenko

12

Дифференциально-диагностические – для распознавания отдельных видов бактерий по их ферментативным свойствам; Специальные - для определения отдельных свойств разных бактерий. Классификация по плотности.

Жидкие (содержат менее 0, 1 % агар – агара. Полужидкие (содержат 0.15 – 0.7 % агар – агара) Плотные (содержат 2 – 15 % агар – агара ). Требования к питательным средам.

Питательность, изотоничность, стерильность, определенная РН (кислотность) среды; определенный еН (электронный ) потенциал, прозрачность.

Чистая культура – бактерии одного вида, выращенные на плотной питательной среде; Колония – видимое невооруженным глазом скопление бактерий на плотной

питательной среде; Штамм – культура микробов одного вида, выделенная из определенного источника;

Клон – культура бактерий, полученная в результате размножения одной клетки.

Ферменты бактерий

Ферменты бактерий по локализации делятся на две группы:

-экзоферменты – выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (например, протеазы, полисахаридазы, олигосахаридазы).

-Эндоферменты – действующие на субстрат внутри клетки (например, ферменты, расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы).

Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи, т.е. для одних – репрессируется, а для других – индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде, называется индуцибельными.

Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными.Их синтез имеет место всегда, и они всегда содержатся в микробных клетках в определенных концентрациях.

Репрессибельные – синтнз которых подавляется в результате избыточного накопления продукта распада реакции.

Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих то или иное соединение в качестве субстрата для трансформации. такой подход позволяет судить об обмене веществ.

Регуляция синтеза ферментов

В бактериальной клетке закодировано большое количество ферментов. Регуляция синтеза ферментов у бактерий подчиняется определенным законам. Информацию о синтезе белка посылает структурный ген, который находится под действием гена-

оператора.Ген-оператор находится под действием гена-регулятора. В активном

числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножаются поперечным делением, некоторые почкованием. Грибы размножаются путем спорообразования.

При размножении микробной клетки наиболее важные процессы происходят в нуклеоиде, содержащем всю генетическую информацию в двунитевой молекуле ДНК. Репликация ДНК происходит полуконсервативным способом, обеспечивающим равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками. Надежность процесса репликации и правильность расхождения (сегрегация) дочерних цепей обеспечивается связью ДНК с цитоплазматической мембраной.

Репликация начинается в определенной точке (локусе) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Синтез дочерних нитей ДНК идет ступенчато, короткими фрагментами, которые сшиваются специальными ферментами лигазой.

Когда бактерия готова к делению, то начинается процесс репликации. При этом

начинается выработка фермента инициатора под действием которого раскручивается ДНК на две равноценные нити. Вторая нить прикрепляется на противоположном участке ЦПМ – прорепликон.

Затем каждая нить достраивается. И после достройки прорепликон превращается в

репликатор.Фермент инициатор освобождается для нового цикла.

Спирали растягиваются к полюсам клетки. ЦПМ образует инвагинации – септальные мезосомы – за счет которых формируется клеточная стенки. Оставшаяся ЦПМ – лизируется соответственным ферментом клетки – аутолизанами. ВЕСЬ

процесс находится под строгим генетическим контролем.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ Для культивирования используют бактерий используют питательные среды. При

культивировании изучаются культуральные свойства – характер роста бактерий на

питательной среде.

Выделяют несколько фаз развития бактерий в питательной среде.

1фаза покоя– лаг. фаза – продолжительность 3-4 часа с момента внесения бактерий в свежую питательную среду. В эту фазу бактерии растут, адаптируются и готовятся к делению.

2фаза интенсивного роста – логарифмического роста. ЕЕ продолжительность 6-8 часов - она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления

клеток, и значительным увеличением числа клеток в популяции;

3 фаза – стационарная, она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться – М-фаза – в эту фазу микробы начинают отмирать. Остальные делятся. Достигается наибольшая концентрация бактерий. В это время (время генерации между 2 делениями) является величиной постоянной.

Для E.coli – 20мин.

Для M. tuberculosis – 16, 18 часов.

15

Это связано с тем, что наступает равновесие между числом в вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М – концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий.

4 фаза – фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.

Прекращение роста численности (размножения) популяции, микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и или накопления в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому удаляя продукты метаболизма или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к установлению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием. Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использовать синхронные культуры – это все члены популяции, которые находятся в одной фазе цикла.

Некультивируемые формы бактерий У многих видов Гр(-) бактерий существует особое приспособительное,

генетически регулируемое состояние, эквивалентное цистам, в которое они могут переходить под влиянием неблагоприятных условий и сохранять свою жизнеспособность до нескольких лет. Главная особенность такого состояния в том, что бактерии в нем не размножаются и не образуют колоний на питательной среде. Такие не размножающиеся, но жизнеспособные бактерии и называются некульвируемыми формами бактерий (НФБ). Клетки этих бактерий находятся в метаболически активном состоянии, они высокоустойчивы к воздействию условиям внешней среды. Для их обнаружения используют методы молекулярногенетического анализа (ДНК-гибридизацию, ПЦР).

Оказалось, что бактериальная клетка в процессе жизнедеятельности продуцирует во внешнюю среду белковые молекулы и ферменты секреции.

Секреция – это активный транспорт белков из цитоплазмы во внешнюю среду. Это необходимо:

1.Для построения клеточной стенки, жгутиков, ворсинок. 2.Прикрепления бактерий к клетки за счет ворсинок.

3.Патогенные бактерии выделяют в окружающую среду, либо в пространство клетки -

эффекторные молекулы.

УГр(+) бактерий выделение идет в один этап.

УГр(-) – обнаружены системы секреции. 5 систем – они отличаются по строению и конечной локализации белка.

внешнюю среду. В этой системе участвуют три белка: А. делают порины в ЦПМ

Б. протягивают молекулу белка через периплазматическое пространство.

В. делают поры в клеточной стенке – через которые белок выделяется во внешнюю среду.

2 тип секреции :

Транспортировка осуществляется в два этапа:

1 этап – белок проникает в периплазматическое пространство и там остаются; 2 этап – некоторые белки через пору в клеточной стенки поступает во внешнюю среду.

3тип секреции :

Принимают участие 20 белков.

Белки первой группы образуют структуру напоминающую шприц.

2 группа белков протягивает эффекторную молекулу по этому каналу в клетку

эукариотической клетки. Таким образом, секреция 3 типа доставляет факторы

ЛЕКЦИЯ4 – Генетика бактерий

Бактериям как и всем живым существам присуща наследственность и изменчивость. Для бактерий существуют те же законы генетики, что и для других живых существ.

Особенности генетического аппарата бактериальной клетки:

1.У бактерий носителем генетической информации является ДНК, но если у

прокариот ДНК имеет линейную структуру, то у бактерий она кольцевая, замкнутая и одна нить фиксирована на ЦПМ. Если раскрутить ДНК бактерий ее длина в сотни раз больше длины клетки – она суперспирализована. Бактериальная клетка содержит одну хромосому – это гаплоидные организмы.

2.У вирусов наследственный аппарат может быть представлен не только ДНК, но и РНК. У бактерий в составе ДНК находятся метилированные минорные

основания, наличия которых предохраняет ДНК от действия собственных эндонуклеаз. ДНК бактерий не содержат гистонов, а их роль выполняют полиамины.

3. Плазмиды бактерий – это миниатюрные двухцепочечные молекулы ДНК, они

кодируют не основные для жизнедеятельности бактеральной клетки функции. Но они придают бактерии новые дополнительные свойства.

Плазмиды в клетке могут находится в одном из двух альтернативных состояний:

17

1.Либо они лежат свободно в цитоплазме и тогда их репликация идет автономно, то есть независимо от репликации хромосом. А так как они значительно меньших размеров, то реплицируются быстрее и в короткое время

накапливается большое количество копий плазмид.

2.Если они находятся в интегрированом состоянии то репликация их синхронна с репликацией хромосомы.

Среди признаков, сообщаемых бактериям плазмидами, выделяют следующие плазмиды кодирующие:

-устойчивость к антибиотикам – Rплазмида;

-продукцию факторов патогенности;

-способность к синтезу антибиотиков;

-способность к биодеградации веществ;

-Col плазмида, которая кодирует синтез бактериоцинов – это вещества белковой природы, которые действуют на близкородственные виды бактерий.

Мобильные элементы генома

IS – последовательности – это участки ДНК, способные перемещаться из одного участка репликона в другой, а так же между репликонами. Они содержат 2 гена :

– 1 ген – кодирует синтез фермента – транспозазу, которая обеспечивает процесс

исключения IS элемента из хромосомы и его интеграцию в новый локус. Отличительной особенностью IS элементов является наличие на концах вставочной

последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза.

- 2 ген – кодирует синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

ТРАНСПОЗОНЫ – это те же IS– последовательности, только еще имеют 1 или два структурных гена, а следовательно, несут генетическую информацию. Например гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическими биологическими свойствами, например, токсичностью.

ИНТЕГРОНЫ. Помимо плазмид и подвижных генетических элементов у бактерий существует еще одна система, способствующая распространению генов - система ИНТЕГРОНОВ. Интегроны являются системой захвата малых элементов ДНК, называемых генными кассетами.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ Различают два вида изменчивостифенотипическую и

генотипическую. Фенотипическая изменчивость не затрагивает генотип это МОДИФИКАЦИИ.

Модификации не передаются по наследству и с течением времени затухают, то есть возвращаются к исходному фенотипу через большое число поколений – длительные модификации или меньшее число поколений – кратковременные модификации.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее основе лежат мутации и рекомбинации.

когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов и протяженные или абберации. В последнем случае могут наблюдаться:

-выпадения нескольких пар нуклеотидов, которые называются делецией;

-добавление нуклеотидных пар – дупликации; -перемещение фрагментов хромосомы – транслокации; -перестановки нуклеотидных пар – инверсии.

Мутации могут быть спонтанными, то есть возникающими самопроизвольно и

индуцированные.

РЕКОМБИНАЦИИ Особенности рекомбинаций у бактерий:

1.У них отсутствует мейоз и образуется не зигота, а мерозигота.

2.Всегда направлены от донора к реципиенту.

3.Рекомбинанты содержат всю генетическую информацию реципиента и плюс

часть генетической информации донора.

ОТМЕЧАЮТ СЛЕДУЮЩИЕ ВИДЫ РЕКОМБИНАЦИЙ:

1.КОНЬЮГАЦИЯ: передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиента путем непосредственного контакта клеток. Необходимым условием для коньюгации является наличие в клетке – донора трансмиссивной

плазмиды.

Трансмиссивные плазмиды кодируют половые пили, образующие коньюгационный мостик между клеткой-донором и клеткой реципиентом, по которому плазмидная

ДНК передается в новую клетку.

2.ТРАНСФОРМАЦИЯ: обмен генетической информации с помощью чистой ДНК.При этом клетки реципиента должны быть компетентными, то есть

готовыми воспринимать генетическую информацию. Компетентность реципиента обусловлена наличием особого белка компетентности, который

- повышает проницаемость клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, -ингибирует ДНК-азы и активирует синтез рестриктаз.

Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Таким образом, деление является оптимальным условием для трансформации.

4. ТРАНСДУКЦИЯ: перенос генетической информации с помощью

трансдуцирующих фагов, как для донора, так и для реципиента.Трансдуцирующий фаг – это умеренный фаг, который в процессе лизогении захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток встраивает эти гены в новый геном. При строгой специфичности фага захватываются и переносятся строго определенные гены.

ТРАНСФЕКЦИЯ- процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки эукариот невирусным методом.Трансфецирование клеток — один из ведущих методов генной инженерии, заключающийся в изменения фенотипа путем введения в клетку

чужеродной нуклеиновой кислоты.

19

Практическое использование генетики – разработка молекулярно-генетических методов диагностики инфекционных заболеваний

1. Рестрикционный анализ – основан на применении ферментов рестриктаз – это эндонуклеазы, которые расщепляют молекулу ДНК, только в определенных местах.

У бактерий выделено более 175 различных рестриктаз для которых известны сайты

(участки) узнавания (рестрикции).

Если выделенную из конкретного микроорганизма ДНК обработать определенной рестриктазой, это приводит к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК различного размера. Размер каждого фрагмента определяют при электрофорезе в агарозном геле и сравнивают с нормой для каждого вида микроорганизмов.

Рестрикционный анализ широко используется для генетического типирования госпитальных штаммов возбудителей внутрибольничной нозокомиальной инфекции, а также с целью проведения других видов эпидемиологического мониторинга.

Молекулярная гибридизация применяется в геносистематике

Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одно-

цепочечной ДНК достраиватьгомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для второй цепи используют ДНК зонды (коммерческие

фрагментымолекулы известной ДНК, гомологичные фрагментам искомой ДНК возбудителя меченные радиоактивным изотопом или ферментом). При наличии

в исследуемом материале гомологичных участков ДНК, по закону комплементарности, ДНК-зонд взаимодействует с ним.

Чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в

исследуемом образце, один зонд фиксируют на мембране. После окончания процесса гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, который содержит зонд, несущий метку. Зонд взаимодействует с искомым участком нуклеиновой кислоты. Окончательная детекция проводится в зависимости от характера метки-ферментно- гибридизационные, флюоресцентные, хемолюминесцентные и т.д.

20

Если зонд находит комплементарный ему одноцепочечный фрагмент, то гибридизируется с ним, образуя двухнитевой комплекс – дуплекс. В случае отсутствия комплементарного зонду фрагмента дуплексы не образуются, и все зонды удаляются при промывании.

Полимеразная цепная реакция

Принцип метода основан на естественной репликации ДНК, которая включает :

-денатурацию спирали ДНК, -расхождение нитей

-комплементарный синтез новых нитей ДНК.

ПЦР обеспечивает амплификацию фрагментов генома и быстрое накопление определенной последовательности ДНК. В результате получают большое количество

ДНК, которое достаточно для проведения анализа различными методами детекции.

Для реализации реакции используют набор праймеров-фрагментов ДНК, которые являются маркерами данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащую денатурированную одноцепочечную ДНК возбудителя, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшиеся двунитевые фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и так повторяется много раз, поэтому реакция носит цепной характер. За 2-3- часа происходит 30-40 циклов амплификации, что приводит к образованию большого количества соответствующих копий нуклеотидных последовательностей, которое можно зарегистрировать.

Компоненты реакции:

1.Праймеры-олигонуклеотиды, которые состоят из 15-30 нуклеотидов, комплиментарных участкам на идентифицируемой матричной ДНК.

2.Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов,которые являются строительным материалом, используемым Tag -полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

3.Tag -полимераза обладает ДНКполимеразной термостабильнойактивностью.

Оптимум ее действия при 720 С. Она способна удленнять праймеры, присоединяя их к 3/ концу.

4.Буферный раствор, катализатор фермента Tag -ДНК- полимеразы.

5.Исследуемый образец - препарат, который служит мишенью для последующей амплификации.

Метод ДНК-чипов Одним из основных методов лабораторной диагностики инфекционных

заболеваний является серологическое обследование пациентов с целью выявления антител к отдельным возбудителям.

При смешанных инфекциях, когда организм поражается сразу несколькими возбудителями, а так же при дифференциации заболеваний, имеющих сходную клиническую картину, часто бывает необходимо выполнение иммунологических тест-систем - ИММУНОЧИПОВ.