88. Ампліфікація днк за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Альтернативним і додатковим до клонування методом збільшення кількості бажаного фрагмента ДНК - ампліфікації - є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, або PCR). Практично

ПЛР - це реакція синтезу ДНК in vitro, яка повторюється багато разів: синтезовані ланцюги стають матрицями для синтезу в наступному циклі реакції. Для здійснення ПЛР треба знати принаймні короткі послідовності ДНК на кінцях того фрагмента, котрий має бути ампліфікований. Реакційна суміш містить слідові кількість вихідної ДНК, надлишкові кількості двох синтетичних праймерів до кінців фрагмента, нуклеозидтрифосфати чотирьох типів і ДНК-полімеразу Taq термофільної бактерії Thermus aquaticus. Використання саме полімерази Taq зумовлено тим, що вона не втрачає своєї активності при нагріванні до високих температур.

У першому циклі ПЛР відбувається нагрівання суміші до 95 °С (денатурація ДНК) і охолодження до 60 °С. Після охолодження до такої все ще досить високої температури ланцюги ДНК не ренатурують, але праймери (оскільки вони присутні в досить високих кон-центраціях) знаходять свої комплементарні ділянки й зв'язуються з ними. Полімераза Taq починає працювати, подовжуючи ці праймери. Усі наступні цикли ПЛР (реакція здійснюється в автоматичному режимі на приладі, що називається ампліфікатором) полягають у нагріванні суміші до 95 °С, яке змінюється охолодженням до 60 °С. Після другого циклу будуть знов синтезовані дві такі самі молекули, як після першого. Після третього циклу - дві такі самі молекули, що й після другого, а також дві молекули, довжина яких чітко обмежена двома праймерами. Далі кількість таких коротких матриць буде зростати, і після 30-го циклу їх

буде в мільйон разів більше, ніж вихідних довгих матриць. Метод ПЛР має надзвичайно широке застосування. Він використовується кожного разу, коли є необхідність детектувати та дослідити невелику кількість ДНК, у тому числі у складі неочищеного біологічного матеріалу. ПЛР застосовують також у комбінації з клонуванням: ампліфікований ДНК-продукт можна клонувати й використати, наприклад, для експресії білка (див. нижче); ампліфікація за допомогою ПЛР стає

в нагоді для збільшення невеликої кількості клонованої ДНК. ПЛР застосовують також для ампліфікації мРНК у вигляді її кДНК-копій - після синтезу кДНК на мРНК за допомогою зворотної транскриптази: варіант ПЛР, що позначається як RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction). Абревіатура RT-PCR використовується також у іншому значенні - Real Time Polymerase Chain Reaction (інше позначення: QRT-PCR - Quantitative Real Time

Polymerase Chain Reaction): процедура, в якій ампліфікація ДНК супроводжується визначенням її кількості після кожного раунду за допомогою флуоресцентних барвників.

89. Поліморфізм та гетерозиготність популяцій

Якщо в популяції існує всього один алель гена, його називають мономорфним, якщо два й більше - поліморфним, а наявність у популяції кількох алельних форм гена - генетичним поліморфізмом. Частка поліморфних генів серед усіх проаналізованих - поліморфність (Р) є одним із показників генетичної мінливості популяцій. Умовним критерієм поліморфності гена є частота його алелів: ген вважають поліморфним, якщо частки хоча б двох алелів перевищують 0,05 або 0,01 (два пороги поліморфності). Якщо ж ця частота не перевищує порогове значення, алель відносять до рідких алелів або до мутацій.

Ще одним показником генетичної мінливості популяції є середня гетерозиготність ( H ). У кожної особини в популяції певна частина генів перебуває в гетерозиготному стані. Частка таких генів (від проаналізованих) характеризує гетерозиготність цієї особини. Усереднена величина індивідуальних значень гетерозиготності для всіх обстежених особин є середньою гетерозиготністю популяції H. Гетерозиготність значною мірою залежить від частоти алелів. Якщо частоти двох алелів одного гена дорівнюють 0,9 та 0,1, то частка гетерозигот становить 2 × 0,9 × 0,1 = 0,18. За частот двох алелів 0,4 і 0,6 частка гетерозигот становитиме вже 2 × 0,4 × 0,6 = 0,48. Найвищими значення гетерозиготності будуть при однаковості частот алелів кожного з генів (1/2 і ½ для двоалельних генів; 1/3, 1/3 і 1/3 для триалельних і т. п.).