79. Репарація днк: основні типи та відповідні молекулярні механізми.

Репарація (repair) ДНК - один із загальних біологічних процесів, який спрямований на виправлення помилок синтезу ДНК при реплікації, а також численних пошкоджень, котрі виникають у ДНК унаслідок дії хімічних і фізичних факторів. До таких пошкоджень відносять різноманітні хімічні модифікації азотистих основ, ковалентні зшивки сусідніх піримідинів (утворення піримідинових, найчастіше тимінових, димерів) під дією ультрафіолетового випромінювання, одно- і дволоанцюгові розриви під дією іонізуючої радіації та вільних радикалів тощо. Часто системи репарації працюють під час або відразу після реплікації. Більшість репараційних процесів передбачає видалення пошкодженої одноланцюгової ділянки з наступним синтезом ДНК за допомогою ДНК-полімераз. Але існують і процеси, пов'язані з безпосереднім виправленням пошкодженого елемента за рахунок прямої дії певних ферментів.

Пряма репарація

Найочевиднішим випадком прямої репарації є зшивання одноланцюгового розриву ДНК лігазою. Іншим спільним для всіх живих організмів (за винятком ссавців) шляхом прямої репарації є фотореактивація - руйнування піримідинових димерів, які були індуковані ультрафіолетовим світлом, ферментом фотоліазою. Фотоліаза (або її власні амінокислотні залишки, або зв'язані з білком простетичні групи) здатна поглинати світло, що призводить до активації ферменту. Тобто світло, яке викликає утворення піримідинових димерів, одночасно активує фотоліазу, котра каталізує розрив ковалентних зв'язків між сусідніми піримідинами, а отже, відновлення структури ДНК.

Одним із загальних пошкоджуючих впливів на ДНК є алкілування азотистих основ - ковалентне приєднання метильних чи етильних груп до атомів О або N. Пряма репарація таких пошкоджень є можливою за рахунок активності специфічних метилтрансфераз, що відщеплюють метильні групи (таким шляхом репаруються О 6 -метилгуанін та О 4 -метилтимін). Ці метилтрансферази не є ферментами: вони відщеплюють метильну групу й необернено ковалентно приєднують її до залишку Cys у своєму активному центрі – для нового акту деметилювання необхідна нова молекула білка.

Ексцизійна репарація

Більш радикальним і ефективним шляхом виправлення порушень нуклеотидів є ексцизійна репарація (excision repair), коли пошкоджена одноланцюгова ділянка вирізається з ДНК, а інший ланцюг використовується далі як матриця для нового синтезу. Існує два варіанти такої репарації.

При ексцизійній репарації азотистих основ (Base Excision Repair -BER), що відбувається в усіх організмів, модифікована азотиста основа видаляється ферментом глікозилазою. Існує певна кількість специфічних глікозилаз, що розпізнають різноманітні модифіковані основи. Глікозилаза руйнує глікозидний зв'язок між основою та С1'-атомом дезоксирибози. У ДНК залишається так званий АП-сайт (апуриновий / апіримідиновий), який упізнається ендонуклеазою, що гідролізує фосфодіефірний зв'язок між 5'-фосфатом звільненої від основи дезоксирибози та попереднім нуклеотидом. Нарешті фосфодіестераза відщеплює цю фосфодезоксирибозу, і в ДНК залишається прогалина довжиною в один нуклеотид. Ця прогалина заповнюється ДНК-полімеразою β (в еукаріотів), яка приєднує нуклеотид до 3'-ОН групи попереднього нуклеотиду ланцюга. Фосфодіефірний зв'язок приєднаного нуклеотиду з наступним нуклеотидом ланцюга відновлюється лігазою. У прокаріотів заповнення прогалини здійснюється ДНК-полімеразою І. При цьому, за рахунок своєї 5'-екзонуклеазної активності, полімераза може руйнувати певну ділянку з 5'-кінця прогалини, одночасно продовжуючи 3'-кінець.

Ексцизійна репарація нуклеотидів (Nucleotide Excision Repair - NER) - процес, пов'язаний із вирізанням ділянки ДНК, яка містить пошкодження (модифіковану основу, тиміновий димер тощо). У клітинах E. coli за цей шлях відповідає система uvrABC (uvr - ultra violet repair). Комплекс білка uvrB і двох білків uvrA впізнає пошкодження та зв'язується з ДНК у цьому місці. На наступному кроці відбувається АТР-залежна зміна конформації uvrB, вигин ДНК і дисоціація uvrA. До комплексу рекрутується білок uvrС. Обидва білки у складі комплексу набувають ендонуклеазної активності: uvrС робить одноланцюговий розріз у пошкодженому ланцюзі за

кілька нуклеотидів у напрямку до 5'-кінця від пошкодження; uvrB - розріз з іншого боку від пошкодження. Довжина ділянки між розрізами дорівнює 12 (або 13 у випадку для тимінового димеру) нуклеотидам. Далі геліказа uvrD руйнує подвійну спіраль між двома розрізами, тобто видаляє пошкоджену ділянку. Прогалина, що залишилася, заповнюється ДНК-полімеразою І, лігаза остаточно відновлює цілісність ланцюга. Аналогічна система ексцизійної репарації працює в еукаріотичних клітинах. До неї залучено близько 17 білків, причому за руйнування подвійної спіралі відповідає геліказна частина загального фактора транскрипції TFIIH. Це забезпечує тісну координацію репарації з транскрипцією: і підвищена ймовірність пошкоджень, і першочергова необхідність виправляти їх виникає насамперед у транскрипційно активних ділянках. Пошкодження розпізнаються або особливими білковими факторами, або РНК-полімеразою, яка робить зупинку на пошкодженому нуклеотиді. Після цього геліказа руйнує ділянку подвійної спіралі довжиною 24-32 пари основ, пошкоджена ділянка вирізається ендонуклеазами, і прогалина заповнюється ДНК-полімеразами δ/ε.

Репарація некомплементарних пар основ – місметчів. Незважаючи на редагування помилок під час реплікації, певна кількість невірно спарених основ залишається в синтезованих ланцюгах

ДНК. Зрозуміло, що при репарації таких місметчів (mismatch) із двох некомплементарних нуклеотидів замінити слід саме той, що входить до синтезованого, а не до матричного ланцюга.

У бактеріальній клітині за репарацію місметчів відповідає так звана система mutHLSU. По бактеріальному геному розподілені (на середній відстані 256 пар основ) короткі паліндромні послідовності CTAG, у складі яких аденін піддається постреплікативному метилюванню.

Але певний час після реплікації метильованим є лише матричний (материнський) ланцюг. Саме за цей час і спрацьовує система репарації: білок, що позначається як mutS, упізнає місметч і рекрутує білок mutL, останній взаємодіє з двома білками mutН, які зв'язуються з тетрануклеотидними паліндромними сайтами по обидва боки від місметча. У складі утвореного комплексу mutН набуває ендонуклеазної активності й робить одноланцюговий розріз у неметильованому ланцюзі в межах одного із сайтів (один із двох сайтів обирається випадково). Далі геліказа mutU (той самий білок, що й uvrD) розплітає подвійну спіраль, а екзонуклеаза руйнує ланцюг від розрізу до місметча й трохи далі. Нарешті прогалина заповнюється ДНК-полімеразою ІІІ, і одноланцюговий розрив зшивається лігазою. Система mutHLSU є консервативною, гомологічні білки присутні також і в еукаріотів. Метилювання аденіну не використовується для

дискримінації ланцюгів: білки еукаріотичної системи репарації місметчів пов'язані з реплісомою та ланцюгами ДНК, що синтезуються, тобто спрацьовують безпосередньо під час реплікації. Репарація без репарації

Іноді в клітині активуються процеси, які прийнято також називати репарацією, хоча насправді вони є засобом здійснити ре плікативний синтез ДНК, не звертаючи уваги на пошкодження її структури. Реплікативна машинерія зазвичай зупиняється, зустрічаючи пошкодження у складі матриці. Якщо таких пошкоджень надто багато, й істинні репараційні системи не встигають їх виправити, перемикання на неточний синтез ДНК дає клітині шанс на виживання. Пошкодження при цьому залишаються і, як наслідок, дають велику кількість мутацій. Усі процеси такого типу зазвичай об'єднують під назвою SOS-репарації або (що точніше) - механізмів синтезу ДНК, толерантних до пошкоджень (damage tolerance mechanisms). У прокаріотів перемикання на неакуратний синтез, який дозволяє долати перешкоди, відбувається завдяки заміні ДНК-полімерази ІІІ на полімеразу низької точності синтезу – ДНК-полімеразу V (полімераза активується у відповідь на несприятливі умови, наприклад, ультрафіолетове опромінювання). Ця полімераза вставляє напроти тимінового димеру дві довільні нуклеотиди (виникає мутація), після чого замінюється на ДНК-полімеразу ІІІ, яка продовжує точний синтез.

Крім того, долати невеликі одноланцюгові прогалини при SOS-репарації допомагає ДНК-полімераза ІІ - полімераза низької точності синтезу. Аналогічно перемикання на полімерази низької точності відбувається і в еукаріотів за наявності в матриці пошкоджених основ, піримідинових димерів тощо. Інший шлях здійснення реплікації через тиміновий димер у складі матриці отримав назву постреплікативної (рекомбінаційної) репарації. У разі наявності тимінового димеру реплісома може його обійти, залишивши прогалину в ланцюзі, що синтезується. У цьому випадку на місце прогалини шляхом гомологічної рекомбінації вставляється ділянка сестринської молекули ДНК. Прогалина, що залишається при цьому в сестринській молекулі, легко заповнюється ДНК-полімеразою. Таким чином, як і при SOS-репарації, пошкодження залишається і може бути виправлено пізніше завдяки ексцизійній репарації.

Репарація дволанцюгових розривів

Точна репарація дволанцюгового розриву ДНК можлива лише під час реплікації, коли розірвана ділянка може бути відновлена завдяки використанню сестринської молекули як матриці за механізмом гомологічної рекомбінації. В інших випадках цілісність розірваних молекул ДНК відновлюється в консервативному для всіх організмів процесі негомологічного з'єдннання кінців (NHEJ - Non-Homologous End Joining). З'єднуються при цьому будь-які кінці ДНК, що, за наявності великої кількості розривів, призводить до об'єднання ділянок різних хромосом, транслокацій тощо. Ключову роль у процесі NHEJ відіграють білки Ku, які (у гетеродимерній формі) упізнають кінці ДНК, об'єднують їх у не ковалентний комплекс і рекрутують до цього комплексу низку інших білків. У складі комплексу відбувається розплітання кінцевих ділянок ДНК і пошук мікрогомології - коротких комплементарних (чи майже комплементарних) одноланцюгових ділянок, які належать різним молекулам. У результаті утворюється короткий дуплекс, зайві одноланцюгові ділянки відщеплюються нуклеазами, лігаза зшиває одноланцюгові розриви. Таким чином, у процесі з'єднання відбувається втрата кількох пар основ. Ця особливість NHEJ-системи використовується при рекомбінації імуноглобулінових генів з метою підвищення розмаїття їхніх послідовностей.