40. Ініціація транскрипції в еукаріотів. Базальні транскрипційні фактори та збірка преініціаторного комплексу рнк-полімерази іі.

В еукаріотичних клітинах працюють три РНК-полімерази:

• РНК-полімераза І працює на кластерах генів рибосомної РНК (розділ 4) і здійснює синтез рРНК 18S, 28S, 5.8S.

• РНК-полімераза ІІ транскрибує білкові гени та гени маленьких ядерних РНК

• РНК-полімераза ІІІ здійснює синтез тРНК, рибосомної РНК 5S та кількох інших низькомолекулярних РНК.

Кожна з цих полімераз містить 4 гомологічні корові субодиниці, які є водночас гомологами субодиниць α, β та β' прокаріотичної полімерази. Крім того, до складу полімераз входять 5 однакових (спільних для усіх трьох) субодиниць, а також певний набір специфічних субодиниць (у кількостях 5, 3 та 7 для РНК-полімераз І, ІІ та ІІІ відповідно). Загальна архітектура еукаріотичних полімераз (наявність щелеп, між якими зв'язується ДНК, каналу виходу РНК, вторинного каналу для входу нуклеозидтрифосфатів) дуже схожа на таку прокаріотичної полімерази.

РНК-полімераза II

Структура РНК-полімерази ІІ

РНК-полімераза ІІ, яка відповідає за синтез мРНК, складається з 12 субодиниць. Найбільша субодиниця (гомолог субодиниці β' прокаріотичної полімерази) формує, зокрема, активний центр, структура й найближче оточення якого є практично ідентичними до таких бактеріальної полімерази.

Особливістю РНК-полімерази ІІ (характерною тільки для цієї полімерази) є наявність так званого CTD (C-Terminal Domain) – С-кінцевого домену найбільшої субодиниці. CTD – це довгий невпорядкований, амінокислотна послідовність якого є гептапептидом Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser, що тандемно повторюється 52 рази. Три залишки Ser у складі гептапептида є субстратами фосфорилювання/дефосфорилювання для специфічних кіназ та фосфатаз. CTD, який відходить від полімерази поблизу від каналу виходу мРНК, є платформою для зв'язування численних білків, спорідненість яких залежить від патерна фосфорилювання. Зокрема, CTD відіграє ключову роль у перемиканні між ініціацією та елонгацією транскрипції та у збірці елементів системи процесингу мРНК під час елонгації.

Для ініціації транскрипції є необхідною збірка на промоторі преініціаторного комплексу (PIC – Pre-Initiation Complex) за участю, принаймні, 12-субодиничної РНК-полімерази ІІ та шести базальних (загальних) факторів транскрипції TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH.

Промотор РНК-полімерази ІІ

Промотор РНК-полімерази ІI може складатися з наступних елементів послідовності (для конкретних промоторів спостерігаються численні варіації цієї схеми). Проксимальні (приблизно у зоні –50 –200 пар основ відносно старту транскрипції) та дистальні (будь-де відносно старту) регуляторні елементи мають спорідненість до специфічних факторів транскрипції, взаємодія з якими активує/блокує збірку преініціаторного комплексу. Якщо дистальний елемент підсилює ефективність ініціації, його називають енхансером (enhancer – підсилювач), якщо навпаки – сайленсером (silencer – глушник). У зоні старту знаходиться так званий базальний промотор, на якому, власне, й відбувається збірка PIC.

Базальний промотор може включати (не обов'язково) три елементи: ТАТА-бокс (починається приблизно з –30 пари основ), ініціаторний елемент (Initiator, Inr) безпосередньо у зоні старту, DPE (Downstream Promoter Element) на відстані приблизно +30 пар основ від старту. Останні два елементи, Inr та DPE, як правило, присутні (якщо присутні) одночасно. Наприклад, приблизно 14% промоторів дрозофіли містять усі три елементи, 29% – тільки ТАТА-бокс, 26% – тільки DPE разом з Inr, 31% не містять жодного з трьох елементів. У останньому випадку промотор визначається іншими, більш специфічними елементами послідовності. Зокрема, досить часто зустрічається так званий GC-бокс, що розташований, як правило, трохи вище (upstream) відносно положення ТАТА-бокса.

Базальні фактори транскрипції

Послідовність збірки преініціаторного комплексу може бути різною, але усі базальні фактори мають бути присутніми у складі РІС для подальшого запуску транскрипції.

TFIID – один з найважливіших базальних факторів, який, зокрема, визначає впізнання стандартних елементів базального промотора (якщо вони присутні). Основою структури TFIID є ТВР (TATA-box Binding Protein) – білок зі специфічною спорідненістю до ТАТА-бокса. Досить широкий β-шар у складі ТВР взаємодіє з маленьким жолобком ДНК, наслідком чого є суттєва деформація подвійної спіралі з її розкручуванням та значним вигином у протилежний від білка бік. Саме з цього протилежного боку (всередині вигину) розташовуються інші білкові компоненти преініціаторного комплексу, які, таким чином, обгортаються промотором. Отже, вигин ДНК, який індукується ТВР, організує промотор і зв'язані з ним елементи у єдиний компактний комплекс і підтримує стабільність цього комплексу. Досить часто (але не обов'язково) зв'язування TFIID ініціює збірку РІС.

Із ТВР у складі TFIID зв'язані так звані ТВР-асоційовані фактори (TAFs – TBP Associated Factors) – 8 або більше (конкретний склад факторів варіює для різних промоторів) білків. TAFs взаємодіють з ТВР та між собою, деякі з них здатні також взаємодіяти з ДНК. Зокрема, TAF_ІІ150 (або його аналог, 150 – молекулярна вага у кілодальтонах) впізнає DPE, тобто забезпечує зв'язування TFIID з базальним промотором, у складі якого відсутній ТАТА-бокс. Якщо у промоторі немає також і DPE, інші TAFs здійснюють білок-білкові взаємодії з факторами транскрипції, що зв'язані з іншими елементами послідовності. Наприклад, GC-бокс впізнається транскрипційним фактором Sp1 (Specificity protein 1), який, у свою чергу, рекрутує TAF_ІІ110, що стає компонентом TFIID через взаємодію з TAF_ІІ250.

Білок TAF_ІІ250 є практично обов'язковим компонентом TFIID (як і ТВР), виконуючи роль основного фактору збірки, з яким взаємодіють інші TAFs. Крім того, TAF_ІІ250 містить у своєму складі бромодомен та гістон-ацетилтрансферазну активність: відповідно, здатен як впізнавати ацетильовані гістони у зоні промоторів, так і здійснювати таке ацетилювання.

TFIIA – гетеродимерний білок, кофактор, що стабілізує комплекс ТВР з ДНК. Відповідно, цей фактор можна було б вважати ще одним TAF. В системах in vitro TFIIA не є необхідним для ініціації транскрипції, проте його відсутність у клітинах дріжджів є летальною.

TFIIB – мономерний білок із мультидоменною структурою. Два С-кінцевих домени взаємодіють з ДНК по обидва боки від сайта зв'язування ТВР, з внутрішнього боку вигину, який індукується цим білком. Таким чином, два білки, які взаємодіють також між собою, зв'язуються з ДНК кооперативно, підсилюючи спорідненість до неї один одного.

Два С-кінцеві домени TFIIB мають різну структуру і взаємодіють з різними елементами ДНК (маленьким та великим жолобками). Така асиметрія (існування двох альтернативних варіантів зв'язування з ДНК) відіграє роль у визначенні напряму транскрипції. Справа в тому, що N-кінцева частина TFIIB (практично не має регулярної вторинної структури) взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ. Таким чином, саме TFIIB визначає положення полімерази на ДНК відносно стартової точки в одній з двох можливих орієнтацій ферменту.

Витягнута N-кінцева частина TFIIB взаємодіє з РНК-полімеразою у зоні активного центра, після початку транскрипції здійснює взаємодії з РНК-ДНК гібридом, а також блокує канал виходу РНК. Тобто, TFIIB певною мірою виконує функції, що є аналогічними до функцій бактеріального σ-фактора. Відповідно, TFIIB має бути звільненим при переході від ініціації до елонгації транскрипції.

TFIIF – гетеродимер, взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ (зокрема, в зоні активного центра), з ДНК, з базальними факторами TFIIЕ та TFIIН. Після первинного плавлення ДНК при ініціації транскрипції TFIIF здійснює взаємодії з нематричним ланцюгом, стимулює роботу TFIIН, запобігає абортивній ініціації. Після завершення ініціації TFIIF разом з іншими базальними факторами дисоціює від РНК-полімерази, але може реасоціювати з нею під час елонгації – у випадку зупинки ферменту. Його роль як фактору елонгації транскрипції полягає у стимуляції продовження руху полімерази.

TFIIЕ – гетеродимер, стимулює роботу TFIIН, взаємодіє з транскрипційним міхуром при ініціації транскрипції.

TFIIН – найбільший з базальних факторів, складається з 10 субодиниць, має молекулярну вагу, порівняну з такою РНК-полімерази. TFIIН – єдиний базальний фактор, що має ферментативні активності. Перша з них – АТР-залежна ДНК-геліказна (гелікази – helicases – ферменти, що розкручують подвійну спіраль). Частина TFIIН взаємодіє з ДНК нижче від активного центра полімерази (по ходу транскрипції). Імовірно, конформаційні зміни білка, зумовлені гідролізом АТР, призводять до розкручування подвійної спіралі, і, оскільки вище від активного центру ДНК є жорстко зафіксованою, це розкручування призводить до локального плавлення дуплекса в зоні стартової точки. РНК-полімераза ІІ є единою з полімераз, яка потребує такої геліказної активності при ініціації транскрипції, – інші РНК-полімерази, еукаріотичні та бактеріальні, утворюють транскрипційний міхур завдяки певних ДНК-білкових взаємодій, яким сприяє негативна надспіралізація.

Друга ферментативна активність TFIIН – кіназна, за рахунок якої здійснюється фосфорилювання С-кінцевого домену РНК-полімерази при переході від ініціації до елонгації транскрипції. У дефосфорильованій формі (форма А РНК-полімерази), на стадії збірки преініціаторного комплексу, CTD взаємодіє з базальними факторами транскрипції; після фосфорилювання певних залишків Ser (форма О РНК-полімерази) ця взаємодія порушується.

Медіатор. Ефективна збірка преініціаторного комплексу є можливою лише за участі ще одного структурного модуля – медіатора (mediator), який містить більше 20 субодиниць (склад варіює для різних промоторів – певний мінімальний набір субодиниць доповнюється більш специфічними за рахунок взаємодії з транскрипційними факторами). Цей мультибілковий комплекс має витягнуту структуру, яку можна розділити на три частини: голова (h, head), середня частина (m, middle) та хвіст (t, tail). Медіатор здійснює лише білок-білкові взаємодії: голова та середня частина взаємодіє з РНК-полімеразою, середня частина та хвіст – зі специфічними факторами транскрипції, що зв'язані на проксимальних та дистальних елементах промотора. Таким чином, медіатор є засобом передачі “активаційних сигналів“ з регуляторних елементів послідовності на РНК-полімеразу: збільшення кількості взаємодій підсилює ефективність збірки РІС.

Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІ

Збірка преініціаторного комплексу є першою подією процесу ініціації. Схему будови комплексу представлено на рис. 6.6: ДНК (базальний промотор) довжиною приблизно 70 пар основ обгортає білкові компоненти РІС. При цьому промоторна ДНК зв'язана головним чином із базальними факторами транскрипції, не з полімеразою, зажим, що формується щелепами полімерази не дозволяє розміститися дволанцюговій ДНК у щілині поблизу від активного центра.

На першому етапі ініціації, таким чином, утворюється закритий преініціаторний комплекс.

Наступна подія – утворення відкритого комплексу – локальне плавлення ДНК за рахунок геліказної активності TFIIH. Нематричний ланцюг після цього захоплюється фактором TFIIF, матричний – занурюється у активний центр, де взаємодіє також з N-кінцевою частиною TFIIВ. Починається синтез короткого первинного транскрипту, коротка гібридна подвійна спіраль стабілізується тим самим N-кінцевим доменом TFIIВ, який при цьому блокує канал виходу РНК.

На наступному кроці спрацьовує кіназна активність TFIIH: відбувається фосфорилювання, яке є точкою перемикання ініціації на елонгацію. CTD втрачає зв'язок із базальними факторами транскрипції, які дисоціюють від полімерази – відбувається очистка промотора. РНК-полімераза продовжує синтез РНК, а частина базальних факторів може залишатися на базальному промоторі й ініціювати зв'язування іншої полімерази.

Після термінації транскрипції (розділ 7) РНК-полімераза зв'язується з TFIIF, який рекрутує специфічну фосфатазу – відбувається дефосфорилювання CTD, і полімераза