Основні компоненти реплісоми та їх функціональна роль.
Процес подвоєння ДНК - реплікація. Реплікація ДНК починається з невеликої ділянки ориджина (origin), де здійснюється ініціація процесу, головним моментом якої є розходження ланцюгів ДНК. Далі по ходу реплікації такий реплікативний міхур розростається у двох протилежних напрямках. На кожному боці міхура існує так звана реплікативна вилка, у основі якої й відбувається синтез ДНК. Ділянку ДНК, де здійснюється реплікація, що розпочинається з однієї точки, називають репліконом.
У реплікативній вилці працює складний мультибілковий комплекс - реплісома, до якого крім двох молекул ДНК-полімерази входять компоненти, що забезпечують розплітання ДНК, підвищення процесивності та виконують інші важливі допоміжні операції.
У клітині E. coli працюють ДНК-полімерази трьох основних типів. Усі вони мають дві ферментативні активності: власне полімеразну і 3'-екзонуклеазну.
• ДНК-полімераза І (або полімераза Корнберга) - мономерний білок із мультидоменною структурою. На відміну від інших ДНК-полімераз вона має також додаткову 5'-екзонуклеазну активність. ДНК-полімераза І використовується як допоміжна полімераза при реплікації та інших процесах синтезу ДНК.
• ДНК-полімераза ІІ залучена до певних репараційних процесів.
• ДНК-полімераза ІІІ - основна реплікативна полімераза, дві копії якої працюють у реплікативній вилці. Складається з трьох субодиниць: субодиниця α відповідає за полімеразну активність, ε - за 3'-екзонуклеазну, θ - виконує структурну роль.
П'ять основних типів еукаріотичних ДНК-полімераз прийнято позначати грецькими літерами.
Полімераза α складається з чотирьох субодиниць: одна виконує структурну роль, друга має ДНК-полімеразну активність, ще дві субодиниці відповідають за активність РНК-полімеразну. Відповідно, полімераза α виконує роль праймази: саме вона синтезує короткий РНК-праймер (6-10 нуклеотидів), який далі трохи подовжує як ДНК. Полімераза α характеризується низькою процесивністю і, на відміну від інших ДНК-полімераз, не має екзонуклеазної активності.
Полімераза β - мономерний білок, основна роль якого полягає в заповненні однонуклеотидних прогалин при ексцизійній репарації основ.
Полімераза γ - реплікативна ДНК-полімераза мітохондрій. Складається з двох субодиниць, крім ДНК-полімеразної має обидві (3'- та 5'-) екзонуклеазні активності.
Полімерази δ та ε - основні реплікативні ДНК-полімерази еукаріотів. Складаються з чотирьох (ε) або трьох – п’яти в різних видів (δ) субодиниць. Обидві полімерази можуть працювати в ре плікативній вилці (у комплексі з PCNA та RF-C) на обох ланцюгах (лідируючому та тому, який запізнюється). Функціональну різницю між двома полімеразами остаточно не з'ясовано. Вважається, що полімераза δ є суто ДНК-синтезуючою машиною, тоді як полімераза ε використовується також як сенсор пошкоджень ДНК, сприяючи активації репараційних процесів. Крім реплікативного синтезу ДНК, полімерази δ і ε здійснюють заповнення довгих багатонуклеотидних прогалин як при з'єднанні сусідніх фрагментів Оказакі, так і при репараційних процесах
Операція розплітання подвійної спіралі (тобто утворення реплікативної вилки) здійснюється ДНК-геліказами - АТР-залежні ферменти. Основною реплікативною геліказою бактерій є білок DnaB - кільцевий комплекс шести однакових субодиниць. У каналі всередині кільця розміщується один полінуклеотидний ланцюг, уздовж якого відбувається транслокація гексамеру в напрямку 5'-3' (тобто по ланцюгу, що запізнюється), що й призводить до руйнування подвійної спіралі. Шість субодиниць гелікази мають сайти зв'язування АТР, де відбувається його гідроліз. Структурні перебудови у відповідь на зв'язування та гідроліз АТР змінюють інтерфейс взаємодії з одноланцюговою ДНК, що й приводить до транслокації на три-п’ять нуклеотидів за один акт гідролізу АТР. Інші реплікативні гелікази побудовані за аналогічними принципами. У розплітанні ДНК під час реплікації беруть також участь гелікази протилежного напрямку (3'-5' - транслокація вздовж лідируючого ланцюга), але, на відміну від DnaB, вони не є життєво необхідними. Геліказа DnaB - це невід'ємний елемент реплісоми, через інші структурні модулі вона зв'язана з ДНК-полімеразами та працює в тісній координації з ними.
Швидкість розплітання ДНК окремою геліказою дорівнює ~35 нуклеотидів за секунду, швидкість руху окремої ДНК-полімерази вздовж одноланцюгової ДНК ~1 тис. нуклеотидів за секунду, при їхньому об'єднанні сумісна швидкість реплікації становить ~750 нуклеотидів за секунду: геліказа трохи гальмує полімеразу, остання - штовхає геліказу. Енергія гідролізу АТР використовується геліказою для здійснення енергетично невигідного процесу розплітання дуплекса.
Тобто одноланцюгова ДНК, що виникає в реплікативній вилці внаслідок активності гелікази, має бути тимчасово стабілізована в одно ланцюговому вигляді. Цю функцію виконують білки SSB (Single Strand Binding), які мають високу спорідненість до одноланцюгової ДНК. SSB білки зв'язуються з полінуклеотидним ланцюгом кооперативно, взаємодіючи не тільки з ДНК, а й між собою. У результаті ланцюг ефективно вкривається білковою «шубою». SSB білки взаємодіють також з іншими компонентами реплісоми, підсилюючи їхню активність – у тому числі активність ДНК-полімерази.
Проблема процесивності вирішується β-білком, який утворює так званий обруч (зажим), що ковзає (sliding clamp). Дві однакові субодиниці обруча, міцно взаємодіючи за принципом «голова до хвоста», утворюють циркулярну тороподібну структуру з отвором приблизно
35 Å у діаметрі. Усередині такого кільця легко розміщується подвійна спіраль ДНК, яка практично не взаємодіє з β-білком. Кільце може вільно рухатись уздовж ДНК, але не може дисоціювати.
С-кінцевий гідрофобний хвіст ДНК-полімерази ІІІ довжиною 11 амінокислот взаємодіє з гідрофобним карманом обруча. У результаті формується своєрідний поводок, що допускає певну свободу рухів полімерази, але міцно утримує її на ДНК. Оскільки обруч білкове кільце, що оточує ДНК, його завантаження на подвійну спіраль виконується АТР-залежним шляхом, ця функція належить γ-комплексу. Відбувається завантаження на гібридній подвійній спіралі РНК-ДНК відразу після закінчення синтезу чергового праймера. γ-Комплекс, що складається з п'яти субодиниць та має U-подібну структуру, зв'язує АТР і змінює свою конформацію таким чином, що взаємодіє з обручем, порушуючи його цілісність – розмикаючи кільце. Далі γ-комплекс впізнає дуплекс, що утворений між праймером та матрицею, забезпечуючи посадку відкритого кільця на цю подвійну спіраль. Взаємодія з дуплексом індукує АТРазну активність γ-комплексу. У результаті гідролізу АТР γ-комплекс втрачає спорідненість до β-білка, що призводить до замикання обруча. Далі γ-комплекс знову зв'язує АТР, проте обруч має вищу спорідненість до ДНК-полімерази, ніж до γ-комплексу: обруч залишається на ДНК і взаємодіє з полімеразою та забезпечує її процесивність. оловну структурну роль в організації реплісоми виконує τ-білок, котрий взаємодіє з ДНК-полімеразою, геліказою, праймазою та утримує на собі γ-комплекс. Численні взаємодії τ-білка забезпечують функціональну координацію між елементами реплісоми. Дві молекули τ-білка взаємодіють між собою і кожна утримує корфермент ДНК-полімерази ІІІ, кожна з яких, у свою чергу, зв'язана з обручем. Одна з полімераз здійснює синтез лідируючого ланцюга, інша - фрагмента Оказакі. Обидві полімерази орієнтовані в реплісомі однаково. Оскільки вони при цьому ведуть синтез на антипаралельних ланцюгах, той, що запізнюється, утворює реверсну петлю: конфігурація реплікативної вилки нагадує тромбон.
